Referatas
Chromatografija
Vilnius
2003
Chromatografija
Viena iš chemijos ir biochemijos užduočių yra atskirti sudedamąsias dalis iš įvairių gamtinių mišinių arba jas atskirti po cheminės ar mikrobiologinės sintezės. Mišinių sudėtis dažnai labai sudėtinga:
sudedamosios dalys būna panašios sandaros, panašių cheminių ir fizikinių savybių. Tokiems mišiniams suskaidyti į sudedamąsias dalis taikomi įvairūs cheminiai ir fizikiniai metodai. Nuo šių metodų efektyvumo prilklauso atskirtųjų medžiagų grynumas. Medžiagų atskyrimas, gryninimas ir valymas yra nepaprastai svarbūs ir pramonėje, ir laboratorijose. Pavyzdžiui, cukraus atskyrimas iš cukrinių runkelių ir cukrašvendrių, vaistinių medžiagų atskyrimas iš augalinių ir gyvulinių žaliavų, baltymų atskyrimas iš kraujo ir kt.
Yra žinoma daug atskyrimo metodų. Tai sedimentacija, ekstrahavimas, dekantavimas, filtravimas, kristalizavimas, distiliavimas. Tačiau dauguma šių klasikinių metodų yra nepakankamai efektyvūs, ypač kai reikia atskirti individualias medžiagas (baltymus, amino rūgštis, pigmentus, sacharidus ir kt.) iš gamtinių junginių mišinių. Todėl, be minėtų metodų, įvairiems mišiniams atskirti dažnai taikoma chromatografija, elektroforezė ir centrifugavimas.
Atrankinių analizinių reakcijų yra nedaug. Todėl prieš kokybinę ir kiekybinę analizę reikia atskirti nustatomuosius junginius (komponentus).
Tarp įvairių metodų, naudojamų medžiagoms atskirti ir analizei, svarbią vietą užima chromatografiniai metodai. Chromatografija paplito dėl atrankumo, paprastumo, analizės atlikimo spartos. Derinant chromatografiją su kitais analizės metodais, galima automatizuoti analizinę kontrolę.
Svarbu ir tai, kad chromatografiniai metodai universalūs, t.y. juos galima taikyti kietiems, skystiems, dujiniams neorganiniams ir organiniams junginiams atskirti bei jų kiekiui nustatyti, be to, yra labai platus nustatomųjų medžiagų koncentracijų, intervalas. Chromatografija naudojama ir junginiams atskirti, ir analizei. Be adsorbcinės chromatografijos neįmanoma įsivaizduoti gamtinių. junginių chemijos (vitaminų, hormonų gamybos), be jonų mainų chromatografijos — baltyminių medžiagų atskyrimo.
Dujų ir didelio slėgio skysčių chromatografija — tai vieni svarbiausių kontrolės metodų chemijos ir biochemijos pramonėje.
Chromatografija pagrįsta sorbciniais vyksmais esant dinaminėms sąlygoms: per kolonėlę, pripildytą susmulkinto nejudančio sorbento (nejudančiosios fazės), leidžiamas dujų, garų ar tirpalo srautas (judančioji fazė). Dėl skirtingų mišinio sudedamųjų dalių savybių (skirtingos adsorbcijos gebos, pasiskirstymo tarp dviejų nesimaišančių skysčių ir kt.) mišinys suskaidomas į sudedamąsias dalis, kurios toliau analizuojamos atskirai. Pagal eksperimento atlikimo metodiką skiriami šie atskyrimo būdai: eliuavimas, frontalinis ir išstūmimo.
Chromatografiškai atskiriant eliuavimo būdu, per kolonėlę, pripildytą sorbento, leidžiamos grynos dujos (tirpiklis) E, kurios beveik nesiadsorbuoja ant pasirinkto sorbento (arba netirpsta nejudančiame skystyje). Po to, nenutraukus judančiosios fazės E srauto, į viršutinę kolonėlės dalį per dozavimo įrenginį įleidžiamas nedidelis kiekis analizuojamojo mišinio (X+Y), kuris išplaunamas nenutrūkstamu judančiosios fazės E srautu. Iš pradžių iš kolonėlės ištekančio judančiosios fazės E
sraute pasirodo silpniausiai besiadsorbuojantis mišinio komponentas X, po to — gryna judančioji fazė E, paskui — stipriau besiadsorbuojantis komponentas Y, vėl judančioJi fazė E ir t.t. Jei ordinačių ašyje atidėsime kurią nors ištekančio dujų (skysčio) srauto savybę, priklausančią nuo jo sudėties, o abscisių ašyje — praleisto per kolonėlę srauto tūrį arba trukmę, tai gausime eliuavimo grafiką, vadinamąją chromatogramą.
Eliuavimas dažniausiai naudojamas dujų, dujų-skysčių chromatografijoje.
Šiuo būdu galima visiškai atskirti visus mišinio komponentus, nes tarp kiekvieno išplaunamo komponento susidaro grynų dujų (tirpiklio) zona.
Eliuavimo trūkumas tas, kad labai praskiedžiama, nes vartojama daug judančiosios fazės, ir atskirtų. komponentų koncentracija būna daug kartų mažesnė už pradinę.
Frontaliniu būdu atskiriama taip: tiriamasis mišinys (X+Y), ištirpintas nesiadsorbuojančiose dujose (tirpiklyje) E, tolydžiai tiekiamas į viršutinę kolonėlės, pripildytos sorbento, dalį ir ištekančiame sraute registruojamos visos komponentų frakcijos. Jei mišinys sudarytas iš keleto komponentų, tai chromatogramoje gaunama keletas pakopų. Pirmiausia iš kolonėlės ištekės grynos dujos (tirpiklis) E, nes X ir Y adsorbuosis. Kai sorbentas prisisotina silpniau besiadsorbuojančio komponento X, tada iš kolonėlės su dujomis (tirpikliu) E pradeda tekėti komponentas X. Pagaliau, sorbentui prisisotinus komponento Y, iš kolonėlės su dujomis (tirpikliu) E pradeda tekėti komponentų mišinys (X+V). Nesant trečio komponento, per sorbento sluoksnį pradės tekėti mišinys, sudarytas iš pradinių medžiagų.
[pic]
Frontalinis būdas naudojamas rečiau, nes grynas gaunamas tik silpniausiai adsorbuojamas komponentas. Kiti komponentai neatsiskiria.
Todėl šiuo būdu valomos tos medžiagos, kurių priemaišos adsorbuojasi stipriau negu valomoji medžiaga.
Norint atskirti išstūmimo būdu, parenkama medžiaga (stūmiklis) S, kuri adsorbuojasi iš tirpiklio E ant pasirinkto sorbento stipriau už bet kurį analizuojamojo mišinio komponentą. Kolonėlė, pripildyta sorbento, pirmiausia praplaunama grynu tirpikliu E. Po to įleidžiamas tam tikras kiekis tiriamojo miŠimo (X+Y) tirpiklyje E. Skirtingai nuo eliuavimo būdo, sorbentas praplaunamas ne grynu tirpikliu E, o stūmikliu S. Įleidus stūmiklio S, mišinio komponentai priklausomai nuo jų adsorbcijos gebos juda išilgai sorbento sluoksnio stūmikliu fronto priekyje. Komponentų judėjimo greitis kolonėlėje lygus stūmiklio S judėjimo greičiui .
Jei bandymo metu stūmiklio koncentracija pastovi, tai pakopos ilgis chiomatogramoje proporcingas komponento kiekiui mišinyje. Šio būdo pranašumas yra tas, kad mišinio komponentai nepraskiedžiami, todėl jų koncentracija chromatografinėje kolonėlėje nemažėja. Tačiau komponentų zonos neatskirtos gryno tirpiklio, todėl šiek tiek persidengia. Dujų chromatografijai šis būdas netinka.
Medžiagų adsorbcija ir pasiskirstymas dviejų skirtingų fazių riboje sudaro daugumos chromatografinių metodų pagrindą. Adsorbcija gali būti fizikinė (molekulinė), chemosorbcija (atomo, molekulės cheminis prijungimas) ir jonų mainai. Fizikinės adsorbcijos pagrindą sudaro tarpmolekulinės van der Valso jėgos ir vandenilinis ryšys: tai adsorbcijos jėgos, lemiančios trauką tarp adsorbuojamų molekulių ir adsorbento.
Daugiakomponentėje sistemoje vyksta atrankinė adsorbcija, kurią sąlygoja atskiriamųjų molekulių ir judančiosios fazės konkurencija dėl paviršiaus.
Konkurencijos rezultatą lemia atskiriamųjų molekulių ir adsorbento adsorbcįjos jėgų skirtumas.
Dėl van der Valso jėgų atsiranda trijų rūšių tarpusavio sąveika:
dispersinė, orientacinė ir indukcinė, Būdinga, kad visoms šioms trims van der Valso jėgų dedamosioms tinka vienas ir tas pats traukos energijos E^
pokyčio priklausomybės nuo atstumo r tarp sąveikaujančių molekulių centrų dėsnis:
[pic]; (1)
Čia C’ — konstanta.
Pagrindinė yra dispersinė sąveika; tai nepolinių molekulių sąveika, atsirandanti dėl trumpalaikių mikrodipolių susidarymo ir sąlygojanti dispersinių jėgų atsiradimą. Adsorbuojantis nepoliniams junginiams ant nepolinių adsorbentų, adsorbcijos energija daugiausia priklauso nuo dispersinių jėgų. Pavyzdžiui, ant aliuminio oksido adsorbuojantis angliavandeniliams, dispersinės jėgos sudaro 100% adsorbcijos energijos, o adsorbuojantis polinėms molekulėms — < 50%. Dispersinės sąveikos energija apskaičiuojama iš lygties:
[pic]; (2)
čia α1 ir α2 — sąveikaujančių molekulių poliarizuojamumai; I1 ir I2 — šių molekulių jonizacijos potencialai.
Orientacinė sąveika — tai orientuotų polinių molekulių sąveika. Todėl orientacinės jėgos atsiranda sąveikaujant dviem molekulėms, turinčioms nuolatinį dipolinį momentą. Tokios molekulės stengiasi orientuotis energiškai palankiausiu būdu, t.y. taip, kad neigiamas krūvis būtų arčiau teigiamo krūvio, Orientacinės sąveikos energija apskaičiuojama iš lygties:
[pic]; (3)
čia μ1 ir μ2 — molekulių dipoliniai momentai;kB — Bolcmano konstanta;
T— temperatūra.
Didėjant temperatūrai, orientacinės jėgos silpnėja, nes padidėja kinetinė molekulių energija, ir molekulių orientacija suyra. Molekulių, kurių dipolinis momentas labai didelis, orientacinis efektas apytiksliai lygus dispersinės sąveikos dedamajai.
Indukcinė sąveika — tai elektrostatinė sąveika, atsirandanti, kai polinės molekulės indukuoja kitų, nepolinių, molekulių nuolatinį dipolinį momentą. Todėl indukcinės jėgos atsiranda tarp sąveikaujančių polinių ir nepolinių molekulių. Šios jėgos gali pasireikšti ir tais atvejais, kai cheminis ryšys turi nuolatinį elektrinį lauką, pavyzdžiui, ryšiai C-CI, C-
NO2. Elektrinio lauko veikiami gretimo atomo, grupės ar molekulės elektronai poliarizuojasi taip, kad susidarytų indukuotasis dipolinis momentas. Indukcinių jėgų įtaka nedidelė: dujų chromatografijoje ji sudaro tik 5—10% bendros adsorbcijos energijos. Šios jėgos dažniausiai sąlygoja adsorbciją ant aliuminio oksido. Indukcinės sąveikos energija apskaičiuojama iš lygties:
[pic]. (4)
Vandenilinis ryšys lemia Junginių, turinčių protonų donorinę grupę, adsorbciją ant nukleofilinio polinio paviršiaus. Toks paviršius būdingas aliuminio oksidui ir silikageliui, kurių paviršiuje išsidėsčiusios hidroksigrupės. Jos gali sąveikauti su silpnomis elektrofilinėmis grupėmis.
Vandenilinio ryšio energija pakankamai didelė ir Jos vertė kartais nedaug skiriasi nuo silpno cheminio ryšio energijos.
Chemosorbcija panaudojama kai kurių klasių junginiams atrankiai sulaikyti. Pavyzdžiui, alkenai sorbuojami ant silikagelio, aminai —
katijonitais. Kartais chemosorbcinės jėgos padeda atskirti junginius, kai chemosorbcija vyksta ant tų adsorbento paviršiaus aktyviųjų centrų, kurie nebuvo visiškai dezaktyvuoti. Pavyzdžiui, silikagelio paviršiuje gali būti rūgštinių centrų, kurie chemosorbuoja bazes, o aliuminio oksido paviršiuje
— bazinių centrų, kurie chemosorbuoja rūgštis. Dėl chemosorbcijos medžiagos dažnai blogiau atskiriamos ir chromatogramose atsiranda išplitusių juostų.
Atliekant adsorbcijos tyrimus, sudaromas medžiagos kiekio ant adsorbento priklausomybės nuo jos koncentracijos tirpale, esant pastoviai temperatūrai, grafikas. Tai vadinamosios adsorbcijos izotermės. Jos gali būti įvairios (2 pav.). Nuo adsorbcijos izotermės pobūdžio priklauso medžiagos pasiskirstymas, judėjimas kolonėlėje bei nustatomojo komponento smailės forma chromatogramoje. Skirtingus izotermių tipus atitinkančios smailių formos parodytos 2 pav.
[pic]
Koncentracija c [pic]
Koncentracija c [pic]
Koncentracija c
2 pav. Adsorbcijos izotermių formos: A — tiesinė; B — iškilioji; C —
įgaubtoji;a — adsorbuotos medžiagos kiekis (medžiagos kiekis nejudančiojoje fazėje); c — medžiagos koncentracija judančiojoje fazėje.
Tiesinę izotermę atitinka simetrinė smailė, rodanti, kad medžiagų koncentracija kolonėlėje pasiskirsto išilgai zonos simetriškai. Tai vadinamoji normalioji arba Gauso kreivės formos smailė. Esant iškiliajai izotermei, gaunama Išplitusi smailė su lėkšta kairiąja puse. Iš izotermės formos galima padaryti tokią išvadą; didėjant ištirpusios medžiagos bendrai koncentracijai, jos kiekis judančiojoje fazėje didėja, be to, judančiosios fazės sluoksniai, kuriuose yra didelė medžiagos koncentracija, juda didesniu greičiu. Esant įgaubtajai izotermei, gaunama išplitusi smailė su lėkšta dešiniąja puse. Viena iš priežasčių, dėl kurių gaunamos tokios formos smailės, yra medžiagų ribotas tirpumas nejudančiojoje fazėje.
Simetrinės smailės dažniausiai susidaro atliekant dujų-skysčių chromatografiją. Pirmosios smailės chromatogramoje, atitinkančios greitai judančias ir ištekančias iš kolonėlės medžiagas, visada yra aukštos ir siauros, o smailės komponentų, judančių kolonėle lėtai, — žemos ir plačios.
Kuo ilgiau bandinys išbūna kolonėlėje, tuo smailė platesnė. Vadinasi, žinant sorbcijos izotermės formą, galima susidaryti vaizdą apie medžiagų pasiskirstymą kolonėlėje, taip pat parinkti sudėtingų mišinių chromatografinio atskyrimo sąlygas.
Bet kuris sorbcijos vyksmas apibūdinamas pasiskirstymo konstanta K:
[pic]; (5)
čia cn — tam tikros vienos apibrėžtos būsenos medžiagos pusiausviroji koncentracija nejudančiojoje fazėje; cj — tos pačios būsenos medžiagos pusiausviroji koncentracija judančiojoje fazėje.
Atliekant chromatografinę analizę, nustatomoji medžiaga gali būti keleto būsenų. Tuo atveju vartojamas pasiskirstymo koeficientas KD, apibūdinantis medžiagos X pusiausvirąjį pasiskirstymą:
[pic]; (6)
čia cn,X ir cj,X – medžiagos X visų būsenų bendra koncentracija atitinkamai nejudančiojoje ir judančiojoje fazėje,
Pasiskirstymo koeficientas KD priklauso nuo nustatomosios medžiagos kilmės judančiosios ir nejudančiosios fazės kilmės, temperatūros, o skysčių chromatografįjoje — nuo tirpalo koncentracijos, pH ir joninės jėgos.
Tiriamosios medžiagos zonos judėjimo greitis atvirkščiai proporcingas KD.
Esant didelėms KD vertėms, didesnė medžiagos dalis yra nejudančiojoje fazėje ir juda lėtai. Jei k.q vertės mažos, tai medžiaga kolonėle juda greitai, t.y. kartu su judančiąja faze, Todėl jei turime dvi medžiagas, kurių KD skirtingas, tai jos kolonėlėje judės skirtingu greičiu, Tai yra svarbiausias chromatografinio atskyrimo veiksnys.
Fiksuojant detektoriumi ištekančio iš kolonėlės srauto sudėties kitimą, gaunama chromatograma. Medžiagų mišinio chromatografinio atskyrimo (pvz, eliuavimo būdu) rezultatų išraiška yra chromatogramos parametrai, vadinamieji sulaikymo parametrai.
Nejudančiosios fazės sorbcinė geba atskiriamų medžiagų atžvilgiu apibūdinama sulaikymo trukme tR. Tai laikas nuo medžiagos įleidimo į sorbento sluoksnį momento iki to momento, kai užfiksuojama medžiagos didžiausia koncentracija ištekančiame judančiosios fazės sraute. Per šį laiką perėjęs per sorbento sluoksnį judančiosios fazės tūris vadinamas sulaikymo tūriu VR:
[pic]; (7)
čia w — tūrinis judančiosios fazės greitis cm3/min.
Nesiribojančio komponento sulaikymo trukmė ir tūris žymimi atitinkamai t0 ir V0. Šį tūrį sudaro laisvas kolonėlės, dozatoriaus ir jungiamųjų linijų tūris. Tai nenaudingas tūris. Atstumais nuo nulinės linijos (linija, lygiagreti su abscisių ašimi) iki smailės viršūnės yra smailės aukštis h, atitinkantis didžiausią komponento koncentraciją cmax, kurią registruoja detektorius. Komponento smailės plotis žymimas b, nors kartais vietoj šio dydžio vartojamas smailės plotis β, išmatuotas, kai smailės aukštis lygus cmax/e (e — natūrinio logaritmo pagrindas), arba plotis b1/2, kai smailės aukštis lygus cmax/2.
Ryšį tarp tikrojo sulaikymo tūrio VR, pasiskirstymo koeficiento KD ir nejudančiosios fazės tūrio Vn kolonėlėje išreiškia pagrindinio chromatografijos dėsnio lygtis:
[pic]. (8)
Matome, kad VR priklauso tik nuo adsorbcijos charakteristikų, šiuo atveju — nuo chromatografuojamos medžiagos pasiskirstymo tarp nejudančiosios ir judančiosios fazių koeficiento.Todėl ši lygtis atitinka tik adsorbcinį atskiriamų junginių sulaikymo mechanizmą. Sulaikymo tūris, į kurį įskaičiuotas nesiribojančio komponento tūris V0, vadinamas koreguotoju sulaikymo tūriu V‘R:
[pic]; (9)
čia t‘R – koreguotoji sulaikymo trukmė.
Įrašę V‘R vertę į (8), gauname:
[pic]. (10)
Tarpfaziniam pasiskirstymui chromatografinėje kolonėlėje apibūdinti chromatografijoje dažnai vartojamas dydis k‘, vadinamas talpos koeficientu.
Šis pavadinimas yra nelabai tinkamas: k‘, kaip ir pasiskirstymo koeficientas KD, apibūdina fazių sistemą, kai medžiagų koncentracijos atitinka tarpfazinio pasiskirstymo izotermės tiesinę dalį, ir jokia funkcine priklausomybe nėra susijęs su sorbcine nejudančios fazės talpa.
Tinkamesnis šio dydžio pavadinimas būtų sulaikymo koeficientas:
[pic]. (11)
Tuomet (8) lygtis gali būti užrašyta taip:
[pic]. (12)
Chromatografinės analizės metu tiriamosios medžiagos komponentai, judėdami išilgai sorbento sluoksnio, pasiskirsto tarp judančiosios ir nejudančiosios fazių. Komponentams skirstantis, medžiagos zona išplinta –
nebūna aiškios ribos. Kuo labiau išplitusios dvi gretimos komponentų zonos, tuo sunkiau juos atskirti (zonos persikloja). Zonų išplitimą aiškina chromatografinio atskyrimo teorijos.
Naudota literatūra
1. Mickevičius D., Cheminės analizės metodai. II dalis. Vilnius. 1999.