Referatas Chromatografija
Vilnius 2003 Chromatografija
Viena iš chemijos ir biochemijos užduočių yra atskirti sudedamąsiasdalis iš įvairių gamtinių mišinių arba jas atskirti po cheminės armikrobiologinės sintezės. Mišinių sudėtis dažnai labai sudėtinga:sudedamosios dalys būna panašios sandaros, panašių cheminių ir fizikiniųsavybių. Tokiems mišiniams suskaidyti į sudedamąsias dalis taikomi įvairūscheminiai ir fizikiniai metodai. Nuo šių metodų efektyvumo prilklausoatskirtųjų medžiagų grynumas. Medžiagų atskyrimas, gryninimas ir valymasyra nepaprastai svarbūs ir pramonėje, ir laboratorijose. Pavyzdžiui,cukraus atskyrimas iš cukrinių runkelių ir cukrašvendrių, vaistiniųmedžiagų atskyrimas iš augalinių ir gyvulinių žaliavų, baltymų atskyrimasiš kraujo ir kt. Yra žinoma daug atskyrimo metodų. Tai sedimentacija, ekstrahavimas,dekantavimas, filtravimas, kristalizavimas, distiliavimas. Tačiau daugumašių klasikinių metodų yra nepakankamai efektyvūs, ypač kai reikia atskirtiindividualias medžiagas (baltymus, amino rūgštis, pigmentus, sacharidus irkt.) iš gamtinių junginių mišinių. Todėl, be minėtų metodų, įvairiemsmišiniams atskirti dažnai taikoma chromatografija, elektroforezė ircentrifugavimas. Atrankinių analizinių reakcijų yra nedaug. Todėl prieš kokybinę irkiekybinę analizę reikia atskirti nustatomuosius junginius (komponentus).Tarp įvairių metodų, naudojamų medžiagoms atskirti ir analizei, svarbiąvietą užima chromatografiniai metodai. Chromatografija paplito dėlatrankumo, paprastumo, analizės atlikimo spartos. Derinant chromatografijąsu kitais analizės metodais, galima automatizuoti analizinę kontrolę.Svarbu ir tai, kad chromatografiniai metodai universalūs, t.y. juos galimataikyti kietiems, skystiems, dujiniams neorganiniams ir organiniamsjunginiams atskirti bei jų kiekiui nustatyti, be to, yra labai platusnustatomųjų medžiagų koncentracijų, intervalas. Chromatografija naudojamair junginiams atskirti, ir analizei. Be adsorbcinės chromatografijosneįmanoma įsivaizduoti gamtinių. junginių chemijos (vitaminų, hormonųgamybos), be jonų mainų chromatografijos — baltyminių medžiagų atskyrimo.Dujų ir didelio slėgio skysčių chromatografija — tai vieni svarbiausių
kontrolės metodų chemijos ir biochemijos pramonėje. Chromatografija pagrįsta sorbciniais vyksmais esant dinaminėmssąlygoms: per kolonėlę, pripildytą susmulkinto nejudančio sorbento(nejudančiosios fazės), leidžiamas dujų, garų ar tirpalo srautas(judančioji fazė). Dėl skirtingų mišinio sudedamųjų dalių savybių(skirtingos adsorbcijos gebos, pasiskirstymo tarp dviejų nesimaišančiųskysčių ir kt.) mišinys suskaidomas į sudedamąsias dalis, kurios toliauanalizuojamos atskirai. Pagal eksperimento atlikimo metodiką skiriami šieatskyrimo būdai: eliuavimas, frontalinis ir išstūmimo. Chromatografiškai atskiriant eliuavimo būdu, per kolonėlę, pripildytąsorbento, leidžiamos grynos dujos (tirpiklis) E, kurios beveiknesiadsorbuoja ant pasirinkto sorbento (arba netirpsta nejudančiameskystyje). Po to, nenutraukus judančiosios fazės E srauto, į viršutinękolonėlės dalį per dozavimo įrenginį įleidžiamas nedidelis kiekisanalizuojamojo mišinio (X+Y), kuris išplaunamas nenutrūkstamu judančiosiosfazės E srautu. Iš pradžių iš kolonėlės ištekančio judančiosios fazės Esraute pasirodo silpniausiai besiadsorbuojantis mišinio komponentas X, poto — gryna judančioji fazė E, paskui — stipriau besiadsorbuojantiskomponentas Y, vėl judančioJi fazė E ir t.t. Jei ordinačių ašyje atidėsimekurią nors ištekančio dujų (skysčio) srauto savybę, priklausančią nuo josudėties, o abscisių ašyje — praleisto per kolonėlę srauto tūrį arbatrukmę, tai gausime eliuavimo grafiką, vadinamąją chromatogramą. Eliuavimas dažniausiai naudojamas dujų, dujų-skysčių chromatografijoje.Šiuo būdu galima visiškai atskirti visus mišinio komponentus, nes tarpkiekvieno išplaunamo komponento susidaro grynų dujų (tirpiklio) zona.Eliuavimo trūkumas tas, kad labai praskiedžiama, nes vartojama daugjudančiosios fazės, ir atskirtų. komponentų koncentracija būna daug kartųmažesnė už pradinę. Frontaliniu būdu atskiriama taip: tiriamasis mišinys (X+Y), ištirpintasnesiadsorbuojančiose dujose (tirpiklyje) E, tolydžiai tiekiamas į viršutinękolonėlės, pripildytos sorbento, dalį ir ištekančiame sraute registruojamosvisos komponentų frakcijos. Jei mišinys sudarytas iš keleto komponentų, taichromatogramoje gaunama keletas pakopų. Pirmiausia iš kolonėlės ištekėsgrynos dujos (tirpiklis) E, nes X ir Y adsorbuosis. Kai sorbentasprisisotina silpniau besiadsorbuojančio komponento X, tada iš kolonėlės sudujomis (tirpikliu) E pradeda tekėti komponentas X. Pagaliau, sorbentuiprisisotinus komponento Y, iš kolonėlės su dujomis (tirpikliu) E pradedatekėti komponentų mišinys (X+V). Nesant trečio komponento, per sorbentosluoksnį pradės tekėti mišinys, sudarytas iš pradinių medžiagų. [pic] Frontalinis būdas naudojamas rečiau, nes grynas gaunamas tiksilpniausiai adsorbuojamas komponentas. Kiti komponentai neatsiskiria.Todėl šiuo būdu valomos tos medžiagos, kurių priemaišos adsorbuojasistipriau negu valomoji medžiaga. Norint atskirti išstūmimo būdu, parenkama medžiaga (stūmiklis) S, kuriadsorbuojasi iš tirpiklio E ant pasirinkto sorbento stipriau už bet kurįanalizuojamojo mišinio komponentą. Kolonėlė, pripildyta sorbento,pirmiausia praplaunama grynu tirpikliu E. Po to įleidžiamas tam tikraskiekis tiriamojo miŠimo (X+Y) tirpiklyje E. Skirtingai nuo eliuavimo būdo,sorbentas praplaunamas ne grynu tirpikliu E, o stūmikliu S. Įleidusstūmiklio S, mišinio komponentai priklausomai nuo jų adsorbcijos gebos judaišilgai sorbento sluoksnio stūmikliu fronto priekyje. Komponentų judėjimogreitis kolonėlėje lygus stūmiklio S judėjimo greičiui . Jei bandymo metu stūmiklio koncentracija pastovi, tai pakopos ilgischiomatogramoje proporcingas komponento kiekiui mišinyje. Šio būdopranašumas yra tas, kad mišinio komponentai nepraskiedžiami, todėl jųkoncentracija chromatografinėje kolonėlėje nemažėja. Tačiau komponentųzonos neatskirtos gryno tirpiklio, todėl šiek tiek persidengia. Dujųchromatografijai šis būdas netinka.Medžiagų adsorbcija ir pasiskirstymas dviejų skirtingų fazių ribojesudaro daugumos chromatografinių metodų pagrindą. Adsorbcija gali būtifizikinė (molekulinė), chemosorbcija (atomo, molekulės cheminisprijungimas) ir jonų mainai. Fizikinės adsorbcijos pagrindą sudarotarpmolekulinės van der Valso jėgos ir vandenilinis ryšys: tai adsorbcijosjėgos, lemiančios trauką tarp adsorbuojamų molekulių ir adsorbento.Daugiakomponentėje sistemoje vyksta atrankinė adsorbcija, kurią sąlygojaatskiriamųjų molekulių ir judančiosios fazės konkurencija dėl paviršiaus.Konkurencijos rezultatą lemia atskiriamųjų molekulių ir adsorbentoadsorbcįjos jėgų skirtumas. Dėl van der Valso jėgų atsiranda trijų rūšių tarpusavio sąveika:dispersinė, orientacinė ir indukcinė, Būdinga, kad visoms šioms trims vander Valso jėgų dedamosioms tinka vienas ir tas pats traukos energijos E^pokyčio priklausomybės nuo atstumo r tarp sąveikaujančių molekulių centrųdėsnis: [pic]; (1)
Čia C’ — konstanta. Pagrindinė yra dispersinė sąveika; tai nepolinių molekulių sąveika,atsirandanti dėl trumpalaikių mikrodipolių susidarymo ir sąlygojantidispersinių jėgų atsiradimą. Adsorbuojantis nepoliniams junginiams antnepolinių adsorbentų, adsorbcijos energija daugiausia priklauso nuodispersinių jėgų. Pavyzdžiui, ant aliuminio oksido adsorbuojantisangliavandeniliams, dispersinės jėgos sudaro 100% adsorbcijos energijos, oadsorbuojantis polinėms molekulėms — < 50%. Dispersinės sąveikos energijaapskaičiuojama iš lygties: [pic]; (2) čia α1 ir α2 — sąveikaujančių molekulių poliarizuojamumai; I1 ir I2 — šiųmolekulių jonizacijos potencialai. Orientacinė sąveika — tai orientuotų polinių molekulių sąveika. Todėlorientacinės jėgos atsiranda sąveikaujant dviem molekulėms, turinčiomsnuolatinį dipolinį momentą. Tokios molekulės stengiasi orientuotisenergiškai palankiausiu būdu, t.y. taip, kad neigiamas krūvis būtų arčiauteigiamo krūvio, Orientacinės sąveikos energija apskaičiuojama iš lygties: [pic]; (3) čia μ1 ir μ2 — molekulių dipoliniai momentai;kB — Bolcmano konstanta;
T— temperatūra. Didėjant temperatūrai, orientacinės jėgos silpnėja, nes padidėjakinetinė molekulių energija, ir molekulių orientacija suyra. Molekulių,kurių dipolinis momentas labai didelis, orientacinis efektas apytiksliailygus dispersinės sąveikos dedamajai. Indukcinė sąveika — tai elektrostatinė sąveika, atsirandanti, kaipolinės molekulės indukuoja kitų, nepolinių, molekulių nuolatinį dipolinįmomentą. Todėl indukcinės jėgos atsiranda tarp sąveikaujančių polinių irnepolinių molekulių. Šios jėgos gali pasireikšti ir tais atvejais, kaicheminis ryšys turi nuolatinį elektrinį lauką, pavyzdžiui, ryšiai C-CI, C-NO2. Elektrinio lauko veikiami gretimo atomo, grupės ar molekulėselektronai poliarizuojasi taip, kad susidarytų indukuotasis dipolinismomentas. Indukcinių jėgų įtaka nedidelė: dujų chromatografijoje ji sudarotik 5—10% bendros adsorbcijos energijos. Šios jėgos dažniausiai sąlygojaadsorbciją ant aliuminio oksido. Indukcinės sąveikos energijaapskaičiuojama iš lygties: [pic]. (4) Vandenilinis ryšys lemia Junginių, turinčių protonų donorinę grupę,adsorbciją ant nukleofilinio polinio paviršiaus. Toks paviršius būdingasaliuminio oksidui ir silikageliui, kurių paviršiuje išsidėsčiusioshidroksigrupės. Jos gali sąveikauti su silpnomis elektrofilinėmis grupėmis.Vandenilinio ryšio energija pakankamai didelė ir Jos vertė kartais nedaugskiriasi nuo silpno cheminio ryšio energijos.Chemosorbcija panaudojama kai kurių klasių junginiams atrankiaisulaikyti. Pavyzdžiui, alkenai sorbuojami ant silikagelio, aminai —katijonitais. Kartais chemosorbcinės jėgos padeda atskirti junginius, kaichemosorbcija vyksta ant tų adsorbento paviršiaus aktyviųjų centrų, kurienebuvo visiškai dezaktyvuoti. Pavyzdžiui, silikagelio paviršiuje gali būtirūgštinių centrų, kurie chemosorbuoja bazes, o aliuminio oksido paviršiuje— bazinių centrų, kurie chemosorbuoja rūgštis. Dėl chemosorbcijos medžiagosdažnai blogiau atskiriamos ir chromatogramose atsiranda išplitusių juostų. Atliekant adsorbcijos tyrimus, sudaromas medžiagos kiekio ant
adsorbento priklausomybės nuo jos koncentracijos tirpale, esant pastoviaitemperatūrai, grafikas. Tai vadinamosios adsorbcijos izotermės. Jos galibūti įvairios (2 pav.). Nuo adsorbcijos izotermės pobūdžio priklausomedžiagos pasiskirstymas, judėjimas kolonėlėje bei nustatomojo komponentosmailės forma chromatogramoje. Skirtingus izotermių tipus atitinkančiossmailių formos parodytos 2 pav. [pic] Koncentracija c [pic] Koncentracija c [pic] Koncentracija c2 pav. Adsorbcijos izotermių formos: A — tiesinė; B — iškilioji; C — įgaubtoji;a — adsorbuotos medžiagos kiekis (medžiagos kiekis nejudančiojoje fazėje); c — medžiagos koncentracija judančiojoje fazėje.
Tiesinę izotermę atitinka simetrinė smailė, rodanti, kad medžiagųkoncentracija kolonėlėje pasiskirsto išilgai zonos simetriškai. Taivadinamoji normalioji arba Gauso kreivės formos smailė. Esant iškiliajaiizotermei, gaunama Išplitusi smailė su lėkšta kairiąja puse. Iš izotermėsformos galima padaryti tokią išvadą; didėjant ištirpusios medžiagos bendraikoncentracijai, jos kiekis judančiojoje fazėje didėja, be to, judančiosiosfazės sluoksniai, kuriuose yra didelė medžiagos koncentracija, judadidesniu greičiu. Esant įgaubtajai izotermei, gaunama išplitusi smailė sulėkšta dešiniąja puse. Viena iš priežasčių, dėl kurių gaunamos tokiosformos smailės, yra medžiagų ribotas tirpumas nejudančiojoje fazėje.Simetrinės smailės dažniausiai susidaro atliekant dujų-skysčiųchromatografiją. Pirmosios smailės chromatogramoje, atitinkančios greitaijudančias ir ištekančias iš kolonėlės medžiagas, visada yra aukštos irsiauros, o smailės komponentų, judančių kolonėle lėtai, — žemos ir plačios.Kuo ilgiau bandinys išbūna kolonėlėje, tuo smailė platesnė. Vadinasi,žinant sorbcijos izotermės formą, galima susidaryti vaizdą apie medžiagųpasiskirstymą kolonėlėje, taip pat parinkti sudėtingų mišinių
chromatografinio atskyrimo sąlygas. Bet kuris sorbcijos vyksmas apibūdinamas pasiskirstymo konstanta K: [pic]; (5) čia cn — tam tikros vienos apibrėžtos būsenos medžiagos pusiausvirojikoncentracija nejudančiojoje fazėje; cj — tos pačios būsenos medžiagospusiausviroji koncentracija judančiojoje fazėje. Atliekant chromatografinę analizę, nustatomoji medžiaga gali būtikeleto būsenų. Tuo atveju vartojamas pasiskirstymo koeficientas KD,apibūdinantis medžiagos X pusiausvirąjį pasiskirstymą: [pic]; (6) čia cn,X ir cj,X – medžiagos X visų būsenų bendra koncentracijaatitinkamai nejudančiojoje ir judančiojoje fazėje, Pasiskirstymo koeficientas KD priklauso nuo nustatomosios medžiagoskilmės judančiosios ir nejudančiosios fazės kilmės, temperatūros, o skysčiųchromatografįjoje — nuo tirpalo koncentracijos, pH ir joninės jėgos.Tiriamosios medžiagos zonos judėjimo greitis atvirkščiai proporcingas KD.Esant didelėms KD vertėms, didesnė medžiagos dalis yra nejudančiojojefazėje ir juda lėtai. Jei k.q vertės mažos, tai medžiaga kolonėle judagreitai, t.y. kartu su judančiąja faze, Todėl jei turime dvi medžiagas,kurių KD skirtingas, tai jos kolonėlėje judės skirtingu greičiu, Tai yrasvarbiausias chromatografinio atskyrimo veiksnys. Fiksuojant detektoriumi ištekančio iš kolonėlės srauto sudėties kitimą,gaunama chromatograma. Medžiagų mišinio chromatografinio atskyrimo (pvz,eliuavimo būdu) rezultatų išraiška yra chromatogramos parametrai,vadinamieji sulaikymo parametrai. Nejudančiosios fazės sorbcinė geba atskiriamų medžiagų atžvilgiuapibūdinama sulaikymo trukme tR. Tai laikas nuo medžiagos įleidimo įsorbento sluoksnį momento iki to momento, kai užfiksuojama medžiagosdidžiausia koncentracija ištekančiame judančiosios fazės sraute. Per šįlaiką perėjęs per sorbento sluoksnį judančiosios fazės tūris vadinamassulaikymo tūriu VR: [pic]; (7) čia w — tūrinis judančiosios fazės greitis cm3/min. Nesiribojančio komponento sulaikymo trukmė ir tūris žymimi atitinkamait0 ir V0. Šį tūrį sudaro laisvas kolonėlės, dozatoriaus ir jungiamųjųlinijų tūris. Tai nenaudingas tūris. Atstumais nuo nulinės linijos (linija,lygiagreti su abscisių ašimi) iki smailės viršūnės yra smailės aukštis h,atitinkantis didžiausią komponento koncentraciją cmax, kurią registruojadetektorius. Komponento smailės plotis žymimas b, nors kartais vietoj šiodydžio vartojamas smailės plotis β, išmatuotas, kai smailės aukštis lyguscmax/e (e — natūrinio logaritmo pagrindas), arba plotis b1/2, kai smailėsaukštis lygus cmax/2. Ryšį tarp tikrojo sulaikymo tūrio VR, pasiskirstymo koeficiento KD irnejudančiosios fazės tūrio Vn kolonėlėje išreiškia pagrindiniochromatografijos dėsnio lygtis: [pic]. (8)Matome, kad VR priklauso tik nuo adsorbcijos charakteristikų, šiuoatveju — nuo chromatografuojamos medžiagos pasiskirstymo tarpnejudančiosios ir judančiosios fazių koeficiento.Todėl ši lygtis atitinkatik adsorbcinį atskiriamų junginių sulaikymo mechanizmą. Sulaikymo tūris, įkurį įskaičiuotas nesiribojančio komponento tūris V0, vadinamas koreguotojusulaikymo tūriu V‘R:
[pic]; (9)
čia t‘R – koreguotoji sulaikymo trukmė.
Įrašę V‘R vertę į (8), gauname:
[pic]. (10)
Tarpfaziniam pasiskirstymui chromatografinėje kolonėlėje apibūdintichromatografijoje dažnai vartojamas dydis k‘, vadinamas talpos koeficientu.Šis pavadinimas yra nelabai tinkamas: k‘, kaip ir pasiskirstymokoeficientas KD, apibūdina fazių sistemą, kai medžiagų koncentracijosatitinka tarpfazinio pasiskirstymo izotermės tiesinę dalį, ir jokiafunkcine priklausomybe nėra susijęs su sorbcine nejudančios fazės talpa.Tinkamesnis šio dydžio pavadinimas būtų sulaikymo koeficientas:
[pic]. (11)
Tuomet (8) lygtis gali būti užrašyta taip:
[pic]. (12)
Chromatografinės analizės metu tiriamosios medžiagos komponentai,
judėdami išilgai sorbento sluoksnio, pasiskirsto tarp judančiosios irnejudančiosios fazių. Komponentams skirstantis, medžiagos zona išplinta –nebūna aiškios ribos. Kuo labiau išplitusios dvi gretimos komponentų zonos,tuo sunkiau juos atskirti (zonos persikloja). Zonų išplitimą aiškinachromatografinio atskyrimo teorijos.Naudota literatūra
1. Mickevičius D., Cheminės analizės metodai. II dalis. Vilnius. 1999.