ELEKTROFOREZĖS METODO TAIKYMAS FERMENTINIŲ PREPARATŲ GRYNUMO NUSTATYMUI

TURINYS

ĮVADAS..............................6
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI..............................8
2. LITERATŪRINĖ DALIS..............................9
2.1. Baltymai..............................9
2.2. Baltymų sudėtis ir struktūra..............................9
2.3. Amonio rūgščių seka baltymų molekulėse.............................11
2.4. Erdvinė baltymų struktūra..............................14
2.5. Baltymų klasifikacija..............................17
2.6. Baltymų savybės..............................17
2.7. Rūgštinės – bazinės baltymų savybės..............................18
2.8. Baltymų biologinis vaidmo..............................19
2.9. Baltymų panaudojimas maistui ir pramonei.............................20
2.10. Elektroforezė..............................21
2.11. Metodo pagrindai..............................21
2.12. Elektroforezės sąlygos..............................24
2.13. Aparatūra ir analizės atlikimas..............................25
2.14. Nešikliai ir jų paruošimas..............................26
2.14.1. Popierius..............................27
2.14.2. Celiuliozės acetatas..............................27
2.14.3. Plonieji nešiklio sluoksniai..............................27
2.14.4. Geliai..............................27
2.15. Kiti elektroforezės metodai..............................28
2.15.1. Elektroforezinė chromatografija..............................28
2.15.2. Laipsninė elektroforezė..............................28
2.15.3. Aukštosios įtampos elektroforezė..............................28
2.16. Metodo taikymas..............................29
3. EKSPERIMENTINĖ DALIS..............................30
3.1. Elektroforezės metodika..............................30
3.1.1. Tirpalų ruošimas..............................30
3.1.2. Dažai..............................31
3.1.3. Elektroforezės atlikimas..............................31
3.1.4. Rezultatų apibendrinimas..............................35
4. EKONOMINIŲ SKAIČIAVIMŲ DALIS..............................37
4.1. Ilgalaikių investicijų apskaičiavimas..............................37
4.2. Medžiagų ir energetinių išteklių vertės apskaičiavimas.......................38
4.2.1. Medžiagų vertė..............................38
4.2.2. Vandens kiekis ir vertė..............................38
4.2.3. Elektros energijos kiekis ir vertė..............................39
4.3. Darbo užmokesčio apskaičiavimas..............................40
4.4. Išlaidų apskaičiavimas..............................40
4.4.1. Išlaidų struktūros apskaičiavimas..............................41
4.5. Kainos apskaičiavimas..............................41
Kaštų struktūra..............................42
5. ŽMOGAUS IR GAMTOS SAUGA..............................43
5.2. Darbų saugos instrukcija dirbančiajam laboratorijoje........................43
5.2.1. Bendroji dalis..............................43
5.2.2. Reikalavimai keeliami laboratorijoje..............................44
5.2.3. Darbuotojų veiksmai preiš darbo pradžią..............................45
5.2.4. Darbuotojo veiksmai darbo metu..............................45
5.2.5. Cheminių medžiagų neutralizavimas..............................46
5.2.6. Darbuotojo veiksmai baigus darbą..............................48
6. IŠVADOS..............................49
LITERATŪRA..............................50

ĮVADAS

Biochemijos institutas Lietuvos Mokslų akademijos (LMA) Prezidiumo 1966 11 23d. nutarimu Nr 470 įsteigtas nuo 1967m. sausio 1d. Šiuo nutarimu nustatytos tokios pagrindinės Institute vykdomų mokslinių tyrimų kryptys: “fermentų struktūros ir modeliavimo tyrimai; dirbtinių biokatalizatarių ir mutageninių mikroorganizmų formas, produkuojančias tam tikrus fermentus ir gyvulininkystei naudingą biomasę; citotoksinių cheminių medžiagų sintezė ir jų poveikio ląstelės gyvybingumui tyrimai; baltymų deficitinių aminorūgščių ir vitaminų iš maistinių ir techninių žaliavų atliekų sintezės, cheminių miikrobiologinių procesų tyrimai”.

Šiuo metu Instituto mokslinės veiklos kryptys yra tokios:
1. Genų struktūros ir ekspresijos reguliavimo tyrimai
2. Ekoriotinės ląstelės funkcinių sistemų veikimo ir reguliavimo tyrimai
3. Biologinių katalizatorių struktūros, funkcionavimo ir praktinio naudojimotyrimai
4. Bioorganinių junginių sintezė, jų savybių ir pritaikymo tyrimai
Visos eilės Instituto mokslininkų tarptautinis pripažinimas su

udarė prielaidas plačiam bendradarbiavimui su Vakarų šalių partneriais, kuris ypatingai suaktyvėjo po Lietuvos nepriklausomybės atkūrimo. Bendrus mokslinius tyrimus Instituto darbuotojai atlieka kartu su JAV, Švedijos, Prancūzijos, Vokietijos, Danijos, Ispanijos, Anglijos, Airijos, Olandijos, Belgijos, Norvegijos universitetais ir kitais moksliniais centrais. Dėka šių tarptautinių ryšių Biochemijos institutas tapo daugelio bendrų mokslinių projektų vykdytoju. Instituto mokslo darbuotojai nuo 1992m. nuolatos vykdo ir didelių užsienio kompanijų užsakytus mokslinius tyrimus. Pastaruoju metu tokiais užsakovais buvo Danijos biotechnologinė kompanija “Novo Nordisk A/S”, Japonijos chemijos ir elektroninių-medicininių prietaisų kompanija “Cheeso” bei cheninių reagentų gamybos firmos “Aldrich” Vokietijos filialas.

Dėka glaudos bendradarbiavimo su daugeliu Lietuvos mokslo ir studijų institucijų, Biochemijos institutui suteikta teisė teikti biologijos ir chemijos krypčių daktaro mokslo laipsnius.

Svarbiu Instituto istorijos etapu buvo naujo Instituto pastato statyba. Grreta pagrindinio skyriaus korpuso taip pat buvo pastatytos atskiros eksperimentinės gamybinės bazės ir vivariumo patalpos. Dabar šiose patalpose yra įsikūrę dešimt pagrindinių Instituto padalinių:
1. Bioanalizės skyrius.

Darbo kryptis: biosensorių kūrimas, naujų bioanalitinių sistemų konstratavimas ir elektronų pernašos tyrimas sistemoje: fermentas – elektrodas.
2. Bioelektrochemijos ir biospektroskopijos skyrius.

Darbo kryptis: struktūrinės funkcinės organizacijos bei elektrocheminių ir bioatpažinimo procesų tyrimai biomembranų sistemose ir jų modeliuose.
3. Bioorganinių junginių chemijos skyrius.

Darbo kryptis: bioorganinių junginių kaip biologinių procesų modeliatorių sintezės metodų paieška, sintezė ir savybių tyrimas. Įvairios paskirties organinių medžiagų resintezė, gausinimas, te
echnologinių sąlygų kūrimas.
4. Fermentų chemijos skyrius.

Darbo kryptis: fermentų struktūros ir funkcijų tyrimas, fermentinės elektrono pernešimo reakcijos, biojutiklių (biosensorių) konstravimas ir jų veikimo analizė.
5. Genų inžinerijos skyrius.

Darbo kryptis: mikroorganizmų genų struktūros, funkcijos ir veiklos reguliavimo tyrimai.
6. Ksenobiotikų biochemijos skyrius.

Darbo kryptis: redoksaktyvių ksenobiotikų sintezė ir tyrimai.
7. Molekulinės mikrobiologijos ir biotechnologijos skyrius.

Darbo kryptys: fermentų biotechnologija nuo mikroorganizmų atrankos, baltymų gryninimo, genų klonavimo ir modifikavimo iki rekombinantinių baltymų tyrimo, modeliavimo ir panaudojimo.
Arenų ir heterociklių mikrobinės degradacijos bioįvairovės tyrimas.
Fermentų, skirtų analitikai, produkcija.
8. Vystymosi biologijos skyrius.

Darbo kryptis: ląstelės augimo, diferenciacijos ir žūties (apoptozės) tyrimas.
9. Patentinės analizės ir informacijos skyrius

Darbo kryptis: teikia techninės informacijos paslaugas.
10. Vivariumas

Darbo kryptis: kancerogenezės mechanizmų tyrimas.

Aš atlikau savo diplominį darbą molekulinės mikrobiologijos ir biotechnologijos skyriuje. Šiame skyriuje dirba 7 darbuotojai: 3 mokslo darbuotojai, viena jaunesnioji mokslo darbuotoja ir kiti techninis personalas.
Šis skyrius tiria mikrobų įvairovę, taip pat kokiomis savybėmis jie pasižymi, klonuoja genus ir juos tiria (didį, sudėtį, DNR), elektroforezės metodu nustato baltymų grynumą, švarumą.
Viena iš panaudojimo sričių yra biosensorių kūrimas.

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Diplominio darbo tikslas – susipažinti su baltymų frakcionavimu ir pritaikyti juos fermentinių preparatų analizei.

Diplominio darbo uždaviniai:
• susipažinti su Instituto veikla;
• surinkti literatūrą apie baltymų savybes ir struktūrą;
• surinkti literatūrą apie elektroforezės metodus;
susipažinti su elektroforezės metodų panaudojimu, baltymų frakcionavimui;
• pritaikyti elektroforezės metodus fermentinių preparatų grynumo bei išgrynintų baltymų molekulinės masės nustatymui.

2. LITERATŪRINĖ DALIS

2.1. Baltymai

Stambiamolekuliniai junginiai, sudaryti iš am

minorūgščių likučių, vadinami baltyminėmis medžiagomis – baltymais. Nėra nė vieno gyvo organizmo, augalo ar gyvūno, kuriame baltymai neatliktų gyvybiškai svarbių funkcijų. Visur, kur yra gyvybė, yra ir baltyminės medžiagos.

Baltymų išorinė išvaizda, jų fizinė būklė gali būti labai įvairi, kaip ir pačios funkcijos, kurias jie atlieka organizme. Kiaušinio, raumenų, skeleto ir sąnarių, odos, plaukų, ragų, kanopų baltymai – visa tai skirtingos baltymų rūšys. Kraujuje yra ištirpusi grupė baltymų, iš jų ir baltymas hemoglobinas, pernešantis deguonį. Piene yra baltymo kazeino ir didelė grupė kitų baltymų. Įvairiausi fermentai – medžiagų apykaitos gyvuosiuose organizmuose katalizatoriai – visi be išimties priskiriami baltyminėms medžiagoms.

Augaluose baltymai, taip sakant, neatlieka “struktūrinių funkcijų”; augalinės ląstelės skeletą sudaro polisacharidas celiuliozė. Tačiau ir augaluose baltymai atlieka ne mažiau svarbias gyvybines funkcijas, susikaupdami daugiausia sėklose.

Kai kurie baltymai atlieka apsaugines funkcijas. Iš jų sudaryti nagai, ragai, kanopos, plaukai, vilna ir t.t.

Labai svarbi baltymų funkcija siejama su medžiagų apykaitos, arba metabolizmo, reiškiniais. Atlikdami įvairias funkcijas organizme, baltymai kinta. Nuolatinis jų molekulių skilimas ir atsinaujinimas sudaro gyvybinių procesų esmę. Visus tokius kitimus katalizuoja vėl baltymai, vadinamieji fermentai arba enzimai. Be fermentų, organizmo gyvybines funkcijas reguliuoja vidaus sekrecijos liaukų produktai – hormonai. Dalis jų taip pat baltyminės medžiagos

2.2. Baltymų sudėtis ir struktūra

Beveik į visų baltymų sudėtį įeina penki elementai: anglis, vandenilis, deguonis, az

zotas ir siera (kai kuriuose esti ir fosforo).

Šių elementų kiekis svyruoja tokiose ribose:

Anglis 50-55%

Vandenilis 6.5-7.3%
Azotas 15-18%

Deguonis 21.5-23.5%

Siera 0.3-2.5%

Baltymų molekulinė masė svyruoja nuo kelių tūkstančių iki kelių milijonų, t.y. aminorūgščių likučių baltymų molekulėje esti nuo kelių dešimčių iki šimtų tūkstančių. Pavyzdžiui, gamtinis polipeptidas oksitocinas – hormonas, kurį išskiria užpakalinė hipofizio dalis, – sudarytas iš 9 aminorūgščių, jo molekulinė masė 1007; adrenokortikotropinio hormono (23 aminorūgštys) molekulinė masė 3200; fermento ribonukleazės (124 aminorūgštys) molekulinė masė 15000; hemoglobino (kraujo baltymo) molekulinė masė 68000, o virusų baltymų molekulinė masė gali būti net 50 milijonų.

Jau vien šios molekulinės masės rodo baltymų įvairovę. Tačiau svarbiausia baltymų įvairumo priežastis, lyginant juos pavyzdžiui su polisacharidais, yra ta, kad į baltymų molekulės sudėtį gali įeiti apie 20 įvairių aminorūgščių, kai paprasti polisacharidai (celiuliozė, krakmolas) esti sudaryti iš vieno monosacharido – gliukozės.

Nuo aminorūgščių sudėties ir jų jungčių tvarkos baltymo molekulėje priklauso pirminė baltymo struktūra. Pavyzdžiui, vieno iš baltyminių hormonų – oksitocino pirminė struktūra išreiškiama šia schema:

NH2 NH2

Cys – Tyr – Ileu – Glu – Asp – Cys – Pro – Leu – Gly – NH2

S S

1 pav. Oksicino pirminė struktūra

kur: Cys – Cisteinas

Tyr – Tirozinas

Ileu – Izoleucinas

Glu – Glutamino rūgštis

Asp – Asparagino rūgštis

Pro – Prolinas

Leu – Leucinas

Gly – Glicinas (glikokolis)

Natūralioje būklėje esančių baltymų savybės priklauso ne tik nuo pirminės struktūros – labai svarbią reikšmę turi baltymų molekulių erdvinė forma. Polipeptidinė grandinė gali būti įvairiausios konformacijos, pavyzdžiui, α – spiralės forma. Polipeptidinės grandinės konformacinės savybės lemia antrinę baltymo struktūrą.

Tam tikros antrinės struktūros grandinė gali, susiklostydama erdvėje, sudaryti tretinę struktūrą.

Veikiami šilumos, cheminių reagentų, baltymai praranda savo natūralias savybes net jeigu ir nevyksta jokie cheminiai pakitimai. Toks procesas vadinamas denatūracija. Jis susijęs su antrinės ir tretinės struktūros pakitimais [7].

2.3. Amino rūgščių seka baltymų molekulėse (pirminė struktūra)

Sintetiniams ir daugeliui gamtinių polimerų būdingas polidispersiškumas. Jų molekulės būna įvairaus ilgio. Eksperimentiškai nustatomas polimerinės grandinės ilgis arba molekulinė masė yra vidutiniai dydžiai. Baltymai – visiška priešingybė. Visos to paties baltymo molekulės yra identiškos, turi tą patį polipeptidinės grandinės ilgį ir tą pačią cheminę struktūrą. Todėl vienas iš baltymų tyrimo uždavinių yra nustatyti polipeptidinėje grandinėje aminorūgščių seką, vadinamą pirmine baltymų struktūra. Pirmasis baltymas, kuriam tai buvo padaryta, – insulinas, polipeptidinės prigimties hormonas, sintetinamas kasos liaukoje ir reguliuojantis cukrų apykaitą. Jei žmogaus organizmas nepagamina insulino, susergama liga, vadinama diabetu, arba cukralige.

Insulino molekulė susideda iš dviejų polipeptidinių grandinių žymimų raidėmis A ir B, sujungtų dviem disulfidiniais tilteliais. Sutrumpintu aminorūgščių žymėjimu insulino pirminę struktūrą galima užrašyti šitaip:

S S

Gly – Ile – Val – Glu – Glu – Cys – Cys – Ala – Ser – Val – Cys – Ser – Leu – Tyr – Glu – Leu – Tyr – Asn – Tyr – Cys –Asn

1 5 S 10 15 S 20

A

S S

Phe – Val – Asn – Glu – His – Leu – Cys – Gly – Ser – His – Leu – Val – Glu – Ala – Leu – Tyr – Leu – Val – Cys – Gly – Glu – Arg – Gly – Phe

1 5 10 15 20 Phe

25

B Ala – Lys – Pro – Thr – Tyr

30
2 pav. Jaučio insulino pirminė struktūra

Susitarta užrašant polipeptido pirminę struktūrą pradėti nuo N – galo ir užbaigti C – galu. N – galinė aminorūgšties liekana žymima pirmu numeriu, kaip parodyta schemoje insulino atveju.

Kaip matome pateiktoje struktūroje, grandinėje A yra 21, o grandinėje B – 30 aminorūgščių. Taigi jaučio insulinas – labai nedidelis baltymas, jo molekulinė masė nesiekia 6000.

Tuo tarpu žmogaus insulinas, kurio aminorūgščių seka ištirta kiek vėliau, skiriasi nuo jaučio insulino tuo, kad trys aminorūgštys pakeistos kitomis:

A grandinė B grandinė

8 9 10 29 30

Jaučio insulinas – Ala – Ser – Val – – Lys – Ala –

Žmogaus insulinas – Thr – Ser – Ile – – Lys – Thr –
Insulino pirminės struktūros nustatymas buvo nepaprastai svarbus biochemijos raidos žingsnis. Pirmą kartą buvo neginčijamai įrodyta, kad visos to paties baltymo molekulės yra vienodos. Dar neužbaigus insulino tyrimo buvo pradėta šifruoti kelių kitų baltymų aminorūgščių sekas. 1960 – 1961 m. paskelbtos trijų baltymų pirminės struktūros. Visuose trijuose baltymuose rasta tik po vieną peptidinę grandinę. Jos ilgis stambiausiame (tabako mozaikos baltyme) – 158 aminorūgščių liekanos. 1963 m. pabaigoje jau buvo žinoma 14 baltymų pirminė struktūra.

Pirminių struktūrų tyrimai svarbūs medicinai. Žinoma nemaža įgimtų ligų, kurių priežastis – vienos ar kelių aminorūgščių pakeitimas konkretaus baltymo peptidinėje grandinėje. Tokių ligų atskleidimu ir diagnoze užsiima nauja medicinos šaka – molekulinė patologija.

Labai svarbų vaidmenį baltymų pirminės struktūros tyrimuose turėjo ir dabar turi N- galinių aminorūgščių liekanų identifikavimas. F. Sendžeris pasiūlė šiam tikslui N – galinių aminorūgščių cheminio žymėjimo metodą. Tai galima pailiustruoti heksapeptido pavyzdžiu. Šarminiame tirpale peptidas veikiamas 2,4-dinitrofluorbenzenu. Galinė aminogrupė, taip pat lizino liekanos aminogrupė sąveikauja su reagentu ir virsta 2,4-dinitrofenildariniais. Modifikuotas peptidas rūgštine hidrolize suardomas iki laisvųjų aminorūgščių. Dinitrofenilo grupė hidrolizės metu neatskyla, todėl N – galinė aminorūgštis ir lizinas lieka pažymėti:

OH¯

O2N F + Ala – Asp – Lys – Gly – Val – Gly

NO2

NO2 NH – CH – CONH – CH – CONH –

NO2 CH3 CH2COO¯

– CH – CONH – CH2 – CONH – CH – CONH – CH2 – COO¯

CH(CH3)2

(CH2)4–NH NO2

20% HCl

NO2 NH – CH – COOH + NH3 – CH – COOH +

CH3 CH2COOH

NO2

+ NH3 – CH – COOH + NH3 – CH2 – COOH +

(CH2)4 – NH NO2

NO2

+ NH3 – CH – COOH + NH3 – CH2 – COOH

CH (CH3)2
3 pav. Dinitrofenilo grupės hidrolizė.

Ekstrahuojant hidrolizės mišinį organiniais tirpikliais, pvz., eteriu, išsiekstrahuoja tik pažymėtoji N – galinė aminorūgštis; visos kitos lieka vandens sluoksnyje.Taip įvyksta todėl, kad stipriai atitraukiant elektronus dinitrofenilo grupė labai sumažina amininio azoto bazingumą (pKa<<0). Net ir stipriai rūgščiame tirpale modifikuotoji N – galinė aminorūgštis yra neutralios jonizacinės formos, todėl tirpsta organiniuose tirpikliuose. Visų kitų aminorūgščių α – aminogrupės visiškai protonizuotos, kaip parodyta reakcijos schemoje, todėl jos organiniuose tirpikliuose netirpsta. Išekstrahuotą žymėtąją N – galinę aminorūgštį nesunku identifikuoti chromatografiniu ar kitu būdu. Dinitrofenilamino grupė suteikia žymėtajai aminorūgščiai geltoną spalvą. Chromatogramose be jokių ryškinančių reagentų matoma geltona dėmelė.

Vėliau buvo pasiūlyta ir kitokių reagentų N – galinei aminorūgščiai pažymėti. Populiariausias iš jų yra dabsilo chloridas. Juo pažymėtos aminorūgšties spalva ryškesnė ir intensyvesnė negu naudojant 2,4-dinitrofluorbenzeną, todėl metodas yra jautresnis.

(CH3)2N N N SO2Cl

4 pav. Dabsilo chloridas

N – ir C – galines aminorūgštis galima identifikuoti fermentiniais metodais. Yra fermentų, kurie atskelia po vieną aminorūgštį nuo peptidinės grandinės N – galo (aminopeptidazės) arba nuo C – galo (karboksipeptidazės). Stebint laisvųjų aminorūgščių koncentracijų didėjimą fermentinės reakcijos mišinyje, atspėjama po 2 – 3 galines aminorūgštis.

Didžiulės daugumos baltymų polipeptidinės grandinės kur kas ilgesnės negu 50 aminorūgščių liekanų. Tiriant pirminę struktūrą, tenka pirmiausia juos suskaidyti į stambius peptidus, kurių kiekvienas tiriamas atskirai. Yra cheminių ir fermentinių metodų peptidinei grandinei specifiškai (norimose vietose) nutraukti. Pavyzdžiui, fermentas tripsinas katalizuoja baltymų hidrolizę ties lizino ir arginino karboksilinėmis grupėmis. Heksapeptidą tripsinas suardo į du tripeptidus:

H2O, tripsinas

Ala – Asp – Lys – Gly – Val – Gly Ala – Asp – Lys + – Gly – Val – Gly
5 pav. Heksapeptido suardimas

Suskaidžius baltymą 2 – 3 būdais ir suradus aminorūgščių sekas gautuose peptiduose, paprastai pavyksta vienareikšmiškai nustatyti baltymo pirminę struktūrą. Bet stambių baltymų, turinčių polipeptidinėje grandinėje 500 – 1000 ir daugiau aminorūgščių liekanų, pirminę struktūrą ištirti yra labai sudėtinga.

Buvo atrastas iš principo naujas baltymų pirminės struktūros tyrimo metodas, kuris papildo aukščiau aprašytus tiesioginius metodus. Yra žinoma, kad baltymų pirminė struktūra yra užkoduota gyvųjų organizmų genuose, nukleino rūgščių sudėtyje esančių purino ir pirimidino bazių sekose. Dabartiniu metu jau mokama gana lengvai nustatyti šių bazių sekas ir tokiu būdu numatyti koduojamų baltymų pirmines struktūras [2].

2.4. Erdvinė baltymų struktūra

Paprastumo galima naudoti įprastą molekulių tūriniams modeliams mastelį (1 Å = 1 cm), vidutinio stambumo baltymo, turinčio 300 aminorūgščių liekanų, ištempto konformero modelis būtų apie 10 m ilgio. Gamtinėmis sąlygomis (vandens terpė, neaukšta temperatūra ir t. t.) baltymų molekulės nebūna ištemptos ar tik šiek tiek susivijusios, o susilanksto į kompaktišką, artimą rutulio formai kamuolėlį, vadinama globula. Baltymui, turinčiam 300 aminorūgščių liekanų, globulos skersmuo yra apie 50 Å, kitaip sakant, jo molekulinį modelį – 10 m ilgio kaspiną turime sulankstyti į 50 cm skersmens kamuolį.

Anglų mokslininkai 1935 m. padarė pirmąsias baltymų kristalų rentgenogramas. Gautas difrakcinis vaizdas rodė, kad globulos yra vienodos. Šie eksperimentai paskatino tirti erdvinę baltymų struktūrą.

Spėjamos struktūros leidžia susidaryti maksimaliam vandenilinių ryšių skaičiui tarp peptidinės grandinės – CO – ir – NH – grupių. Abi šios grupės yra hidrofilinės, t. y., linkusios būti supamos vandens molekulių. Dalyvavimas vandeniliniuose ryšiuose kompensuoja solvataciją, todėl α – spiralės ir β – struktūros (5, 6 pav.) gali egzistuoti hidrofobiškoje baltymo globulos vidaus aplinkoje. Vandeniliniai ryšiai yra pagrindinis veiksnys, lemiantis peptidinių grandinių erdvinį išsidėstymą. α – Spiralės matmenys tokie, kad virš peptidinio ryšio deguonies atomo stovi ketvirtos iš eilės aminorūgšties – NH – grupė. Tarp deguonies ir vandenilio atomų susidaro vandenilinis ryšys. Vienos spiralės ilgis – 5,4 Å, joje telpa 3,6 aminorūgščių liekanų.

A B
6 pav. α – Spiralinė peptidinės grandinės struktūra

7 pav. β – Struktūra

Malonu pastebėti, kad 1995 m. paskelbta erdvinė struktūra pirmojo baltymo, kurį tiriant pagrindinį vaidmenį atliko Lietuvos mokslininkai. Ištirtasis baltymas – nukleino rūgštis specifiškai hidrolizuojantis fermentas restriktazė Cfr 10I buvo išgrynintas ir iškristalizuotas Vilniuje, Biotechnologijos institute, rentgenostruktūriniai tyrimai atlikti kartu su Vokietijos specialistais. Šio baltymo pavyzdžiu galima susipažinti su baltymų erdvinės struktūros žymėjimu ir bendrais principais. 7 paveiksle, A ir B, parodyti restriktazės Cfr 10 I globulos tūriniai modeliai, paryškinant hidrofilines ir hidrofobines aminorūgščių šonines grupes. Aiškiai matyti, kad hidrofobinės šoninės grupės susirinkusios globulos viduje, be to, jos supakuotos labai kompaktiškai, nepaliekant tuščios vietos. Globulos viduje paprastai nebūna vandens molekulių. Hidrofobinės šoninės grupės susirinkusios globulos viduje, be to, jos supakuotos labai kompaktiškai, nepaliekant tuščios vietos. Globulos viduje paprastai nebūna vandens molekulių. Hidrofilinės šoninės grupės daugiausia yra globulos paviršiuje. Taip yra todėl, nes tokia erdvinė struktūra termodinamiškai naudingiausia vandens tirpale. Būtent evoliucijos eigoje per atsitiktines mutacijas susikūrė pirminės baltymų struktūros, kad pasidarė galimas būtent toks susilankstymas į globulas.

A B

8 pav. Restriktazės Cfr 10 I tūriniai modeliai: A – baltymo globulos vidus (pjūvis), B – baltymo globulos išorė.

Paprasčiausi erdvinės struktūros elementai (α – spiralės, β – struktūros, vingiai) vadinami antrine baltymų struktūra. Visas peptidinės grandinės ir šoninių grupių išsidėstymas erdvėje vadinamas tretine struktūra. Tretinė baltymo struktūra – tai visa jo globulos erdvinė struktūra, kurią gauname iš rentgenostruktūrinės analizės. Pastaraisiais metais išmokta rasti nedidelių baltymų tretines struktūras iš BMR spektroskopijos duomenų. Tai yra svarbu, nes tyrimas atliekamas tirpale, nereikia gauti baltymo kristalo. Daugelio baltymų nepavyksta iškristalizuoti.

Kai kurių baltymų pavyzdžiu įrodyta, kad būdinga jiems tretinė struktūra susidaro savaime, ji yra termodinamiškai stabiliausias baltymo konformeras. Būtent, tretinę baltymo struktūrą nulemia pirminė struktūra. Mokslininkai deda daug pastangų išmokti teoriškai numatyti, kokia bus baltymo tretinė struktūra, jei žinoma pirminė. Bet pasiekimai dar labai kuklūs.

Pastaraisiais metais įrodyta, kad savaime susidaro tik paprastesniųjų, nedidelės molekulinės masės baltymų tretinė struktūra. Ląstelėse egzistuoja specialūs baltymai, vadinami čaperonais, kurie padeda teisingai susivynioti į globulas sudėtingesniesiems baltymams.

Daugelio baltymų globulos linkusios jungtis į stambesnius asociatus, sudarytus iš 2,3 ir daugiau narių. Tokie asociatai vadinami ketvirtine baltymų struktūra, o įeinančios į jų sudėtį baltymo globulos – subvienetais. Ketvirtinė struktūra gali būti sudaryta iš vienodų arba iš skirtingų subvienetų. Pavyzdžiui, auglių nekrozės faktorius yra trimeras, sudarytas iš vienodų subvienetų; hemoglobinas –tetrameras, sudarytas iš dviejų porų skirtingų subvienetų. Ketvirtinė struktūra dažniausiai labai labili, nes subvienetų neriša kovalentiniai ryšiai, o tik tarpmolekulinės sąveikos jėgos [2].

2.5. Baltymų klasifikacija

Baltymai, kuriems hidrolizuojantis susidaro vien tik aminorūgštys, vadinami proteinais. Atsižvelgiant į savybes ir biologines funkcijas, baltymai biochemijoje skirstomi į daugelį grupių (pavyzdžiui, albuminai, globulinai, protaminai, glutelinai).

Sudėtiniai baltymai, arba proteidai, yra baltymų ir nebaltyminės dalies junginys. Atsižvelgiant į nebaltyminės dalies tipą, skiriami šių grupių proteidai:
1. Fosfoproteidai
2. Lipoproteidai
3. Glikoproteidai
4. Nukleoproteidai
5. Chromoproteidai

2.6. Baltymų savybės

Baltymų molekulės turi laisvas karboksilo ir amino grupes. Priklausomai nuo tų grupių santykio, molekulė turi teigiamą arba neigiamą krūvį, kuris taip pat priklauso ir nuo terpės pH. Rūgščioje terpėje baltymų molekulė įsielektrina teigiamai, nes jonizojasi aminogrupė, o šarminėje – neigiamai, nes disocijuoja karboksilas. Kiekvienam baltymui būdinga tokia pH reikšmė, kai jo teigiami krūviai kompensuoja neigiamus. Tai baltymų izoelektrinis taškas. Daugumos baltymų izoelektriniai taškai mažesni už pH = 7.

Baltymų tirpumas labai nevienodas: vieni jų tirpsta vandenyje, kiti – tam tikros koncentracijos druskų tirpaluose, treti vandeniniuose – alkoholiniuose tirpaluose. Yra ir visiškai netirpių.

Baltymų nusodinimas druskomis vadinamas išsūdymu. Druskų jonams atėmus hidratuotą vandenį, baltymų molekulės sukimba į didesnius agregatus, kurie ir iškrenta nuosėdomis. Dažniausiai baltymai išsūdomi amonio sulfatu.

Gryniems baltymams gauti reikia pašalinti druskų priemaišas. Tai atliekama dializuojant baltymų tirpalą. Sparčiau už dializę druskos pašalinamos, praleidžiant baltymų tirpalą pro kolonėlę su sefadeksu. Iš kolonėlės išteka grynas baltymų tirpalas, o jonai susilaiko kolonėlėje.

Be lengvųjų metalų druskų, baltymus grįžtamai nusodina organiniai tirpikliai: etanolis, acetonas, eteris.

Vario, gyvsidabrio, švino ir kitų sunkiųjų metalų druskos sudaro kompleksus su SH bei kitomis grupėmis, todėl jau nedideli tų druskų kiekiai baltymus nusodina. Kartais tokius nusodintus baltymus vėl galima ištirpinti, bet dažniausiai jie nusėda negrįžtamai. Šis reiškinys vadinamas baltymų denatūracija.

Denatūruojami baltymai netenka daugelio savybių, visų pirma biologinio aktyvumo. Šiuo atžvilgiu jie yra labai jautrios medžiagos.

Baltymai denatūruojasi, net paprastoje temperatūroje koncentruojant jų tirpalus, todėl siekiant išvengti denatūracijos, baltymų tirpalai koncentruojami veikiant sefadeksu, kuris sugeria vandenį. Kietos formos baltymus patogiausia gauti liofilizacijos būdu. Tam tikslui baltymų tirpalas užšaldomas vakuume, vanduo iš lėto sublimuojasi, ir gaunamas miltelių pavidalo preparatas, kuris tinkamomis sąlygomis ilgą laiką išlieka nepasikeitęs.

Svarbus baltyminių medžiagų požymis – spalvinės reakcijos. Iš jų sprendžiama, kokios atomų grupės yra baltymų molekulėje. Pavyzdžiui, virinami su azoto rūgštimi, baltymai nusidažo geltonai (ksantoproteino reakcija). Tai rodo, kad baltymų molekulėje yra aromatinis žiedas. Šildomi su sidabro nitrato tirpalu azoto rūgštyje, kurioje esama nedaug nitritinės rūgšties (Milono reagentu), baltymai nusidažo raudonai. Tai rodo, kad jų molekulėje yra fenolio likutis. Tokių spalvinių reakcijų žinoma ir daugiau [1].

2.7. Rūgštinės – bazinės baltymų savybės

Žinoma, kad iš baltymuose esančių 20 aminorūgščių septynių šoninės grupės gali jonizuotis. Kartu su galinėmis amino- ir karboksiline grupėmis jos suteikia baltymo globulai elektrinį krūvį, kurio ženklas ir dydis priklauso nuo tirpalo pH. Kiekvienam baltymui egzistuoja pH reikšmė, kuriai esant globulos elektrinis krūvis lygus nuliui. Šis pH vadinamas baltymo izoelektriniu tašku ir žymimas pI, lygiai taip pat, kaip aminorūgštims. Kai pHpI, neigiama. Suprantama, kad pI<7 tų baltymų, kuriuose vyrauja aminorūgštys, turinčios rūgštines šonines grupes (aspargo ir glutamo rūgštys). Ir atvirkščiai, pI>7 yra tų baltymų, kuriuose daugiau bazinių aminorūgščių – lizino, arginino. Pavyzdžiui, insulino pI = 4,8.

Baltymo izoelektrinis taškas yra labai svarbi konstanta. Kai pH = pI, baltymo tirpumas yra minimalus, jis linkęs koaguliuoti – sudaryti nuosėdas. Norint baltymą nusodinti, tikslinga daryti pH artimą pI. Kai norim baltymą ištirpinti, pH geriau parinkti pakankamai skirtingą nuo pI.

Globulos elektriniu krūviu pagrįsti svarbiausi baltymų atskyrimo ir gryninimo metodai -elektroforezė ir jonų mainų chromatografija. Esant pHpI ir globula neigiama, baltymas juda link teigiamo elektrodo, sorbuojasi ant anijoninių sorbentų.

2.8. Baltymų biologinis vaidmuo

Ira žinoma daug baltymų, kurie yra biokatalizatoriai. Tai svarbiausias jų biologinis vaidmuo. Kiekvienoje gyvoje ląstelėje vyksta tūkstančiai cheminių reakcijų, ir tik nedaugelis jų yra nekatalitinės. Baltymai, kurie katalizuoja biocheminius procesus, vadinami fermentais, arba enzimais. Fermentai yra labai specifiški katalizatoriai, jie paprastai pagreitina tik vieną reakciją. Galima teigti, kad kiekvienai biocheminei reakcijai, tiksliau, kiekvienai jos stadijai egzistuoja atskiras fermentas.

Fermentų tyrimais užsiima biochemijos mokslo šaka enzimologija. Medžiagos, kurių pakitimus fermentas katalizuoja, vadinamos substratais. Fermento pavadinimas paprastai sudaromas prie substrato pavadinimo pridedant galūnę –azė. Dažnai dar į pavadinimą įterpiamas žodžio fragmentas, nurodantis reakcijos tipą.

Pagal katalitinio veikimo efektivumą ir specifiškumą fermentai toli lenkia cheminėje pramonėje naudojamus neorganinius katalizatorius, todėl fermentinės reakcijos pakankamai greitai vyksta fiziologinėmis sąlygomis – vandens tirpale 20 – 40° temperatūroje. Tipiškas reakcijos pagreitėjimas dėl fermentinės katalizės yra 10 – 10 kartų, palyginti su nekatalitine reakcija. Fermentas stabilizuoja reakcijos tarpinę būseną labiau negu pradines medžiagas, todėl sumažėja aktyvacijos energija, ir reakcija pagreitėja.

Fermentų specifiška savybė – atpažinti “savuosius” substratus, nesupainioti jų su panašiomis molekulėmis, glaudžiai susijęs su baltymų erdvine struktūra. Kiekvienas fermentas turi aktyvų centrą, tą globulos paviršiaus dalį, kurioje vyksta katalitinis procesas. Aktyvaus centro erdvinė struktūra atitinka substrato struktūrą, panašiai kaip spyna atitinka raktą. Greta grynai erdvinio atitikimo, matyt, labai svarbus elektroninės struktūros atitikimas: ant kontaktuojančių fermento ir substrato paviršių išsidėstę elektriniai krūviai, elektronodonorines savybes turinčios grupės.

Yra baltymų, kurie transformuoja gyvybei reikalingą energiją ir ją perduoda. Jie maistą paverčia šiluma, chemine ir mechanine energija. Raumenų darbą irgi atlieka baltymai. Ši baltymų funkcija savais mechanizmais artima jų katalitinei, fermentinei funkcijai. Daugeliu atvejų abi šios funkcijos sutampa.

Kiti baltymai atlieka apsaugines, atramines funkcijas, įeidami į ląstelių sienelių, apsauginių audinių, kaulų sudėtį. Pagrindinis odos komponentas yra baltymas kolagenas, plaukų – baltymas keratinas.

Baltymai yra pagrindiniai imuninės sistemos veikėjai, atpažįstantys į organizmą pakliuvusius svetimkūnius ir juos surišantys.

Gyvybės žemėje evoliucijos eigoje susiformavo labai sudėtinga automatizuota gyvybės cheminių procesų sistema, kurioje baltymai yra pagrindiniai veikėjai [2].

2.9 Baltymų panaudojimas maistui ir pramonei.

Augalai gali sintetinti aminorūgštis ir baltymus, imdami azotą iš neorganinių junginių. Gyvūnai normaliam egzistavimui turi gauti baltymus su maistu. Baltymai virškinimo procese suskaidomi į smulkiamolekulinius peptidus arba aminorūgštis, kurie įsiurbiami žarnyno ir kraujo išnešiojami po organizmą. Tai ir yra ta statybinė medžiaga, iš kurios organizmas sukuria savo kūno baltymus. Taigi baltymai maisto racione visiškai gali būti pakeisti aminorūgštimis. Kai kurias gyvybei reikalingas aminorūgštis organizmas gali pats pasigaminti iš kitų azotinių junginių, patenkančių su maistu. Yra aminorūgščių, kurių organizmas negali susintetinti ir jas reikia pateikti su baltyminiu maistu. Tokios aminorūgštys vadinamos nepakeičiamos. Joms priskiriama lizinas, triptofanas, fenilalaninas, valinas, metioninas, treoninas, leucinas, izoleucinas, histidinas, argininas.

Yra nustatyta, kad baltyminis maistas turi turėti reikalingą nepakeičiamųjų aminorūgščių kiekį. Gaunant nepakankamai nepakeičiamųjų aminorūgščių, sutrinka normali organizmo veikla.

Žmogus jam reikalingus baltymus gauna iš gyvulininkystės bei augalininkystės produktų.

Pastaruoju metu žemės ūkio gyvulių raciono maistinei vertei pakelti į pašarą pridedama labiausiai “deficitinių” aminorūgščių. Šiam tikslui organizuota stambi lizino, glutamino rūgšties ir metionino pramoninė gamyba. Lizinas sintetinamas iš kaprolaktato, t.y. iš tos pačios žaliavos, kaip ir kapronas. Į jį įvedama nitrogrupė, paskui redukuojama, kartu suardant laktamo ciklą.

Kai trūksta maiste lizino, susergama amenija, skauda galvą, padidėja jautrumas. Sintetinio lizino dedama į maistą vaikams, norint pagerinti apetitą, gydant sunkius apsinuodijimus; gyvulininkystėje jo dedama į pašarus.

Glutamino rūgštis pramonėje gaminama iš akrilo nitrilo. Ji dedama į konservus ir maisto koncentratus skoniui pagerinti.

Baltymai turi ne tik maistinę, bet ir pramoninę reikšmę. Pati stambiausia sritis, užsiimanti baltyminės žaliavos perdirbimui – odų pramonė. Baltyminės medžiagos yra natūralus šilkas ir vilna. Baltymas kazeinas, išskiriamas iš pieno, vartojamas klijams gaminti; ankščiau labai vertinama buvo plastmasė, gaunama iš kazeino (galatitas); buvo bandyta iš kazeino gauti dirbtinį pluoštą. Baltyminėms medžiagoms priskiriama želatina, vartojama kinofotomedžiagų gamyboje, taip pat maisto pramonėje [7].

2.10. Elektroforezė

Elektroforezės reiškinys pagrįstas elektrinio lauko veikiamų elektringųjų koloidinių dalelių arba polimero molekulių pernešamu elektrolito tirpale vieno ar kito elektrodo link. Nuo elektrolizės, kurios metu, tekant per tirpalą elektros srovei, ant elektrodų nusėda ekvivalentinių kiekių elektrolizės produktai, elektroforezė skiriasi tuo, kad jos metu medžiaga pernešama tiktai viena kryptimi. Todėl elektroforezei negalioja Faradėjaus dėsnis, kuris kiekybiškai apibūdina elektrolizę. Nepaisant to, tarp šių abiejų reiškinių yra tiesioginis ryšys.

2.11. Metodo pagrindai

Koloidiniuose tirpaluose dispersinės fazės ir dispersinės terpės sąlyčio zonoje susidaro dvigubasis elektrinis sluoksnis: koloidinė dalelė įgyja tam tikro dydžio ir ženklo krūvį. Daugelis biologiniu atžvilgiu svarbių molekulių – aminorūgštys, peptidai, baltymai, nukleorūgštys, turi grupių, kurios gali jonizuotis, todėl tirpalose šie junginiai gali egzistuoti kaip katijonai arba anijonai, t. y., turėti krūvį. Be to, molekulės, turinčios panašaus dydžio krūvį, bet skirtingą masę, skiriasi viena nuo kitos ir krūvio kiekiu, tenkančiu masės vienetui. Dėl šių skirtumų elektringosios dalelės tirpale, veikiamos elektrinio lauko, yra atskiriamos. Tai ir sudaro elektroforezės pagrindą.

Dispersinės sistemos fazių judėjimą elektriniame lauke lemia dvigubojo elektrinio sluoksnio susidarymas prie tarpfazinių paviršių. Skiriamos trys tarpusavyje susijusios dvigubojo elektrinio sluoksnio susidarymo priežastys: paviršiaus funkcinių grupių disociacija, elektrolito jonų adsorbcija ir polinių molekulių orientacija tarpfazinėje riboje. Dėl tarpusavio sąveikos dalelė įgauna teigiamąjį arba neigiamąjį krūvį. Dvigubąjį elektrinį sluoksnį, t. y., savitąjį plokščiąjį kondensatorių, sudaro du lygiagretūs elektrodai. Vienas elektrodas – tai potencialą suteikiantys jonai, esantys tiesiog prie dalelės paviršiaus, antrasis – skystoje fazėje esantys priešjoniai.

Dalis priešjonių taip pat yra prie dalelės paviršiaus ir sudaro tankujį adsorbcijos sluoksnį, kuris vadinamas Helmholco sluoksniu. Kita dalis priešjonių dėl šiluminio judėjimo išplinta į skystosios fazės gilumą, sudarydami vadinamąjį difuzinį, arba Guji sluoksnį. Tariama, kad tankiojo Helmholco sluoksnio storis lygus priešjonio skersmeniui. Tolstant nuo dalelės paviršiaus, potencialas tolygiai mažėja. Pagal Guji ir Čepmeno teoriją priešjoniai dvigubojo elektrinio sluoksnio difuzinėje dalyje pasiskirsto dalelės paviršiaus potencialo lauke pagal Bolcmano pasiskirstymo dėsnį. Pagal šią teoriją potencialas difuzinėje sluoksnio dalyje, tolstant nuo paviršiaus, mažėja eksponentiškai. Difuzinio sluoksnio storis mažėja didėjant elektrolito jonų koncentracijai, jonų krūviui ir žemėjant temperatūrai.

Elektrokinetinio potencialo dydis labai priklauso nuo tirpale esancių elektrolitų. Didėjant priešjonių koncentracijai tirpale, daugiau jų per slinkimo plokštumą patenka į adsorbcinį sluoksnį: difuziniame sluoksnyje jų lieka mažiau ir šis sluoksnis plonėja. Dėl to potencialas mažėja ir jo vertė artėja prie nulio. Būsena, kai potencialas lygus nuliui, vadinama izoelektrine. Kai sistema yra izoelektrinės būsenos, dalelės suminis krūvis lygus nuliui ir elektrinis laukas dalelių neveikia, t. y., elektroforezė nevyksta. Bet tai nereiškia, kad dalelių paviršiuje nėra jonų. Potencialą suteikiančių jonų skaičius nepakinta, bet jų krūvį visiškai kompensuoja į nejudamą adsorbcinį sluoksnį patekę priešjoniai.

Amfoterinių kietųjų kūnų ir makromolekulių, turinčių įvairių jonogeninių grupių (baltymų, nukleorūgščių ir kt.), paviršiaus elektrinio potencialo dydis ir ženklas priklauso nuo tirpalo pH; izoelektrinę būseną atitinka tam tikra pH vertė. Amfoteriniams hidroksidams šią pH vertę lemia rūgštinės ir bazinės disociacijos konstantų santykis. Baltymų molekules sudarančių aminorūgščių šoninėse grandinėse yra daug įvairių rūgštinių ir bazinių grupių, taip pat –COOH ir –NH2 grupių. Šioms grupėms būdinga skirtingos disociacijos konstantos, todėl baltymo molekulės joninė būsena tirpale, esant tam tikrai pH vertei, apibūdinama sudėtinga įvairių jonogeninių grupių jonizacine pusiausvyra. Paprasčiausiu atveju izoelektrinėje būsenoje susidaro baltymo jonai H3N–R–COO¯:

R R R

H HO¯

H3N – CH – COOH H3N – CH – COO HOH3N – CH – COO

H HO¯

izoelektrinė būsena

Joninė forma: katijonas anijonas

Judėjimo kryptis: prie katodo nejuda prie anodo

Šią būseną atitinkanti tirpalo pH vertė vadinama izoelektriniu tašku. Žinoma, kada įvairių baltymų aminorūgščių sudėtis yra skirtinga, tai izoelektriniai baltymų taškai taip pat nevienodi (4.4 lentelė). Baltymo dalelių elektros krūvio ženklas nustatomas elektroforeze.
Baltymas pH
Kraujo serumo globulinas 4.5
Kazeinas 4.7
Želatina 4.7
Kiaušinio albuminas 4.8
Hemoglobinas 6.8
Histonas 8.7

1 lentelė. Izoelektrinio baltymų taško pH vertės

Be izoelektrinio taško, kuris nustatomas iš elektrokinetinių efektų, dažnai vartojama izojoninio taško sąvoka. Izojoninis taškas – tai tokia tirpalo pH vertė, esant kuriai poliamfolitas sorbuoja vienodą katijonų ir anijonų kiekį. Izojoninio taško padėčiai dažniausiai turi įtakos stipriausios rūgštinės ir bazinės grupės. Jei skystoje terpėje nėra elektrolito priedo, izojoninio ir izoelektrinio taško pH vertės sutampa. Įpylus į tokią terpę elektrolito, kurio jonai gali adsorbuotis, izoelektrinis ir izojoninis taškai pasislinks į priešingas puses nuo pH vertės, būdingos grynai skystajai terpei. Pavyzdžiui, jei makromolekulei esant izoelektrinėje (izojoninėje) būsenoje įpilsime elektrolito, kurio katijonai stipriai adsorbuojasi, makromolekulė gaus papildomą teigiamąjį krūvį. Dėl šio papildomo krūvio suirs makromolekulės rūgštinių ir bazinių grupių disociacijos pusiausvyra: iš teigiamąjį krūvį turinčios makromolekulės bus išstumiami H jonai ir padidės rūgštinių grupių disociacijos laipsnis; kartu bus pritraukiami HO¯ jonai, todėl sumažės bazinių grupių disociacija. Toks rūgštinių ir bazinių grupių disociacijos laipsnio pokytis iš dalies kompensuoja katijonų adsorbcijos metu atsiradusį teigiamąjį makromolekulės krūvį. Norint, kad makromolekulė vėl būtų izoelektrinės būsenos, būtina, keičiant tirpalo pH, padidinti HO¯ jonų koncentraciją. Adsorbuoti šie jonai visiškai kompensuos teigiamąjį krūvį, kurį makromolekulė gavo adsorbuodama katijonus iš įpilto elektrolito. Vadinasi, esant savitajai katijonų adsorbcijai, izoelektrinis taškas pasislinks į šarminę pusę. Priešingai, kad būtų pasiekta izojoninė būsena, būtina kompensuoti rūgštinių grupių disociacijos laipsnio padidėjimą dėl katijonų adsorbcijos, t. y., parūgštinti tirpalą. Analogiškai, esant savitajai anijonų adsorbcijai, izoelektrinis taškas pasislinks į rūgštinę, o izojoninis – į šarminę pusę.
Matome, kad priklausomai nuo įpilamo elektrolito kilmės jonų mainai gali turėti įtakos įvairioms dvigubojo elektrinio sluoksnio dalims: difuzinei, adsorbcinei ir net potencialą suteikiančių jonų daliai (pastaruoju atveju teisingiau būtų kalbėti ne apie jonų mainus, o apie jonų įsiskverbimą). Lengviausiai pakeičiami difuzinio sluoksnio priešjoniai.
Taip pat žinome, kad dalelių judrumui elektriniame lauke turi įtakos relaksacijos ir elektroforezinis efektai. Dėl elektrostatinių jėgų poveikio kiekviena dalelė tirpale yra apsupta priešingo krūvio jonų (vadinamosios joninės atmosferos) ir hidratinio vandens. Dalelei judant elektriniame lauke, už dalelės esanti joninė atmosfera suyra, o jos priekyje formuojasi iš naujo: suyra difuzinio sluoksnio apie dalelę sferinė simetrija. Dėl to susidaro lyg dipolis, kuris mažina elektrinio lauko efektyvųjį dydį, kartu ir dalelės judėjimo greitį bei potencialą, t. y., dalelė stabdoma. Tai vadinamasis relaksacijos efektas. Tarp relaksacijos efekto, joninės atmosferos storio ir kitų veiksnių yra sudėtinga priklausomybė. Į šį efektą galima nekreipti dėmesio tik tam tikromis sąlygomis. Elektroforezinis efektas taip pat susijęs su jonine atmosfera: dėl elektrinių jėgų priešpriešinis priešjonių srautas sukelia papildomą trintį, ir tai trukdo dalelei judėti elektriniame lauke [5].

2.12. Elektroforezės sąlygos

Elektroforeziniam dalelių judriui įtakos turi daugybė veiksnių: bandinio būsena, elektrinio lauko parametrai, buferinio tirpalo ir nešiklio charakteristikos. Bandinio būseną galima nusakyti krūviu, dalelės matmenimis ir forma. Didėjant dalelės suminiam krūviui, judrumas didėja. Krūvio dydis priklauso nuo pH. Kuo stambesnės dalelės, tuo mažesnis jų judrumas. Tas susiję su didesne trinties jėga bei stambių molekulių elektrostatine sąveika su aplinka. Vienodų matmenų, bet skirtingos formos, pavyzdžiui, fibrilinių (plaušų pavidalo) ir globulinių (kamuoliukų pavidalo) baltymų molekulių judrumas yra skirtingas. Tas taip pat siejama su trinties jėgomis ir elektrostatine sąveika.
Matome, kad bandinio dalelių judrumas priklauso nuo jų krūvio. Dalelės, kurios krūvis sudėtinis, migracijos kryptis priklauso nuo to, koks yra suminis krūvis. Didesnių matmenų dalelės juda lėčiau, o dalelės, neturinčios krūvio, arba, kai teigiamųjų ir neigiamųjų krūvių dydžiai yra lygūs, nemigruoja.
Elektrinio lauko įtaka dalelių atskyrimui priklauso nuo nuolatinės srovės stiprio, įtampos ir varžos. Kadangi elektros srovės stiprį tirpale lemia buferinis tirpalas ir bandinio dalelių pernaša, tai dalelių judėjimo greitis tiesiogiai proporcingas srovės stipriui. Dalelių nueitas kelias proporcingas elektroforezės trukmei, todėl elektroforezės metu nuolatinės srovės stipris neturi keistis. Norint, kad geriau kartotųsi elektroforezės rezultatai, naudojami stabilizuoti maitinimo šaltiniai, kurie palaiko tam tikro dydžio nuolatinę įtampą arba srovės stiprį. Dalelių migracijos greitis atvirkščiai proporcingas varžai, kuri savo ruožtu priklauso nuo buferinio tirpalo joninės jėgos, nešiklio rūšies ir jo smulkumo. Didėjant nešiklio sluoksnio ilgiui, varža didėja, o didėjant nešiklio sluoksnio pločiui ir buferinio tirpalo jonų koncentracijai, varža mažėja. Elektroforezės metu skiriasi šiluma, todėl varža mažėja. Esant tam tikro dydžio nuolatinei įtampai, dėl tokio įšilimo didės srovės stipris ir labiau garuos tirpiklis. Dėl tos priežasties srovės stiprį stengiamasi parinkti tokios vertės, kad išsiskirianti šiluma būtų lygi šilumai, kurią elektroforezės celė atiduoda aplinkai (sistema bus pusiausviroji).
Buferiniai tirpalai palaiko pastovų nešiklio pH, taip pat įvairiais būdais veikia migracijos greitį. Dažniausiai vartojami formiatiniai, acetatiniai, citratiniai, fosfatiniai, kompleksono III ir piridininiai buferiniai tirpalai. Sacharidams atskirti dažnai vartojami boratiniai buferiniai tirpalai, nes jie su sacharidais sudaro krūvį turinčius kompleksinius junginius. Kadangi buferiniai tirpalai gali būti ir kaip bandinio tirpikliai, tai elektroforezės metu galima tam tikra bandinio dalelių difuzija. Tai ypač būdinga mažoms molekulėms (aminorūgštims, cukrui). Difuziją galima sumažinti iki minimalios, jei bandiniai bus uždedami ant nešiklio nedideliais kiekiais siauromis juostelėmis, taip pat naudojant aukštą įtampą bei mažinant elektroforezės trukmę. Baigus elektroforezę, bandiniai turi būti skubiai išimami ir išdžiovinami.
Labai svarbi buferinio tirpalo charakteristika yra jo koncentracija. Didėjant buferinio tirpalo joninei jėgai, srovės dalis, tenkanti buferinio tirpalo jonų pernašai, didės, o srovės dalis, tenkanti bandinio dalelėms, mažės. Taigi bandinio migracijos greitis mažės. Esant didelei buferinio tirpalo joninei jėgai, suminė srovė didės, kartu didės ir išsiskiriančios šilumos kiekis. Esant mažai joninei jėgai, srovė, tenkanti buferinio tirpalo jonų pernašai, bus maža, o srovės dalis, tenkanti bandinio dalelėms, didelė, todėl bandinio migracija didės. Buferiniame tirpale, kurio yra maža joninė jėga, bendras srovės stipris mažės, kartu mažės ir šilumos išsiskyrimas, tačiau padidės difuzija, kartu sumažės skiriamoji geba. Vadinasi, parenkant buferinio tirpalo joninę jėgą, priimamas kompromisinis sprendimas. Dažniausiai vartojamų buferinių tirpalų joninė jėga atitinka koncentraciją nuo 0,05 iki 0,1 mol/1. Visiškai disocijuojančioms medžiagoms (pavyzdžiui, neorganinėms druskoms) buferinio tirpalo pH didesnės įtakos neturi. Tačiau nuo tirpalo pH dydžio priklauso organinių junginių jonizacijos laipsnis. Pavyzdžiui, didėjant tirpalo pH, organinių rūgščių jonizacija didėja, o bazių, atvirkščiai, mažėja. Amfolitų judėjimo greitis ir kryptis taip pat priklauso nuo tirpalo pH, jiems atskirti galima vartoti buferinius tirpalus, kurių pH yra nuo 1 iki 11 [5].

2.13. Aparatūra ir analizės atlikimas

Elektroforezės aparatūra susideda iš dviejų pagrindinių dalių: maitinimo šaltinio ir elektroforezės celės. Naudojami žemosios (100 – 500 V) ir aukštosios (500 – 10 000 V) įtampos stabilizuotos nuolatinės srovės šaltiniai, kuriais sudaromas atitinkamai 20 ir net 200 V/cm įtampos gradientas. Srovės stipris, naudojant žemosios įtampos šaltinį, būna iki 150 mA. Elektroforezės celę sudaro buferinių tirpalų kameros, nešiklių padėklai ir elektrodai. Dažniausiai naudojami platinos vielos elektrodai, bet tinka ir elektrodai iš nerūdijančiojo plieno, anglies.
Eksperimentinė elektroforezė skirstoma į mikroskopinę, judančiosios ribos ir zoninę. Visi šie elektroforezės metodai skiriasi elektroforezės celės konstrukcija ir analizės atlikimo technika. Atskirų koloidinių dalelių elektroforezė gali būti tiriama stebint šių dalelių judėjimą mikroskopu arba ultramikroskopu, todėl šis elektroforezės metodas vadinamas mikroelektroforeze. Mikroelektroforezės aparatą sudaro skaidri celė, į kurią sufokusuotas mikroskopas, elektrodai ir pagalbiniai tirpalo pripildymo bei valymo įrenginiai.

Dauguma mikroskopu nematomų dalelių (baltymai, lipoproteinai, antikūnai, plovikliai, virusai) gali adsorbuotis mikroskopu matomų dalelių paviršiuje (kvarco, stiklo, kitokių dalelių). Taip padidinamos mikroelektroforezės galimybės. Mikroelektroforezė – patogiausias elektrokinetinių reiškinių tyrimo metodas, kai remiantis gautais eksperimentiniais rezultatais daromi teoriniai apibendrinimai.

Metodai, kurie remiasi makroskopiniais vyksmų, susijusių su elektroforezine dalelių pernaša, matavimais, vadinami makroskopine elektroforeze. Vienas iš jų yra judančiosios ribos metodas, kuris dažnai taikomas baltymų tirpalams tirti. Dirbant pagal šį metodą būtina, kad tarp tiriamojo tirpalo (baltymų, koloidinio tirpalo) ir pagalbinio elektrolito būtų aiški riba. Šiai elektroforezei reikia sudėtingos ir brangios aparatūros, todėl laboratorijose ji retai atliekama.

Analizei plačiausiai taikoma zoninė elektroforezė. Ja galima atskirti tiek mažo skersmens neorganinius jonus, tiek dideles makromolekules. Pagrindinis skirtumas tarp zoninės elektroforezės ir ankščiau minėtų yra tas, kad zoninei elektroforezei reikalingi nešikliai. Elektroforeziniam atskyrimui skirta medžiaga ištirpinama buferiniame tirpale. Buferiniu tirpalu taip pat prisotinamas nešiklis arba jame išbrinkinamas gelis.

Kitas reiškinys, turintis įtakos elektroforeziniams tyrimams, yra elektroosmoso efektas. Šio reiškinio priežastis – krūvio atsiradimas tarp buferinio tirpalo vandens molekulių ir nešiklio paviršiaus. Dažnai į šį efektą galima nekreipti dėmesio, bet, nustatant medžiagos izoelektrinį tašką, reikia padaryti tam tikras pataisas. Jų dydžiui nustatyti matuojamas elektriškai neutralių junginių (karbamido, gliukozės) judėjimo greitis. Elektroosmoso efektas silpnesnis, jei vartojamas celiuliozės acetatas arba poliakrilamido geliai. Šis reiškinys akivaizdus vartojant popierių arba krakmolo gelį. Parenkant gelį reikia neužmiršti, kad juose krūvį turinčios makromolekulės elektroforeze atskiriamos ne tik dėl to, kad skiriasi jų judris, bet ir dėl formos bei matmenų skirtumo. Todėl, vadovaujantis konkrečiais atskyrimo reikalavimais, parenkami geliai, kurių porų matmenys yra įvairūs [5].

2.14. Nešikliai ir jų paruošimas

Elektroforezėje naudojama labai daug įvairių nešiklių, iš kurių minėtini: chromatografinio popieriaus arba celiuliozės acetato lapai, silicio ir aliuminio oksidų ploni sluoksniai, krakmolo, agaro ir poliakrilamido geliai. Visi šie nešikliai prisotinami tam tikro buferinio tirpalo. Nešiklis parenkamas pagal konkrečias analizės sąlygas. Bendra visų nešiklių ypatybė yra ta, kad atskiriamosios medžiagos juda aiškiomis zonomis ir zonose susitelkusias medžiagas po to lengva nustatyti kitais analizės metodais.
2.14.1. Popierius. Specialaus elektroforezinio popieriaus nėra – vartojamas įprastas chromatografinis popierius. Elektroforezės metu medžiaga visuomet popieriaus yra adsorbuojama. Adsorbcijai sumažinti vartojami buferiniai tirpalai, kurių pH yra didesnis negu bandinio izoelektrinio taško.
Nešiklis prisotinamas buferinio tirpalo prieš uždedant bandinį: chromatografinis popierius tiesiog panardinamas į buferinį tirpalą. Prisotintas buferinio tirpalo chromatografinis popierius gali būti padėtas gulsčiai arba stačiai.
Tiriamosios medžiagos bandinys ant chromatografinio popieriaus užlašinamas mikropipete. Užlašinimo vieta (centre, prie katodo ar anodo) priklauso nuo to, koks yra atskiriamojo mišinio komponentų krūvis.
Popieriaus elektroforezė – paprastas ir dažnai taikomas metodas. Jis tinka daugeliui krūvį turinčių dalelių atskirti. Pastaruoju metu vis dažniau vartojami celiuliozės acetato nešikliai ir geliai.
2.14.2. Celiuliozės acetatas. Šis nešiklis pasižymi nedidele absorbcine geba, todėl gerai atskiriamos net ir stambios makromolekulės. Juostelės iš celiuliozės acetato padedamos ant buferinio tirpalo ir leidžiama joms laisvai plaukioti paviršiuje tol, kol visiškai prisisotina buferinio tirpalo. Celiuliozės acetatas, palyginti su chromatografiniu popieriumi, yra ne toks hidrofilinis ir jame telpa mažiau buferinio tirpalo. Todėl didesnę srovės dalį perneša bandinio jonai, kartu ir greičiau jie atsiskiria.

2.14.3. Plonieji nešiklio sluoksniai. Naudojami plonieji silicio oksido, aliuminio oksido, diatomito arba celiuliozės sluoksniai, uždėti ant stiklinės plokštelės. Plokštelės dedamos gulsčiai į elektroforezės celę ir plonajam nešiklio sluoksniui difuzijos būdu leidžiama prisisotinti buferinio tirpalo. Elektroforezės celės kameros su buferiniu tirpalu sujungiamos su plonuoju nešiklio sluoksniu specialiais tilteliais arba storo filtro popieriaus juostele.

2.14.4. Geliai. Daugumą gelių (agaro, krakmolo, poliakrilamido ir kt.) būtina ruošti prieš pat jų vartojimą. Agaro gelyje būna tik 1%, t. y., agaras turi daug vandens, todėl, vartojant šį gelį, elektroforezės metu dalelės juda labai greitai. Dėl šios savybės agaras labai patogus antigenams aptikti ir atskirti, taip pat nukleorūgščių elektroforezei. Krakmolo geliui paruošti reikia iš dalies hidrolizuoto krakmolo ir tam tikro buferinio tirpalo. Mišinys iš pradžių šildomas, po to atšaldomas. Šios procedūros metu susidaro pusiau standus darinys. Krakmolo geliams buferinis tirpalas parenkamas empiriškai.

Makromolekulėms atskirti dažniausiai vartojami poliakrilamido geliai. Šie geliai pasižymi daugybe gerų savybių, dėl kurių gana plačiai vartojami. Iš jų minėtinos: gelio akučių matmenis galima labai keisti, gelį galima vartoti su įvairiausiais buferiniais tirpalais, atskiriama labai sparčiai, adsorbcija ant gelio ir elektroosmoso efektas labai nedideli ir kt.

Preparatams atskirti elektroforezė poliakrilamido gelyje atliekama ant gulsčių plokštelių. Eksperimento metu elektroforezės celė būtinai uždengiama dangteliu: tada iki minimalaus sumažinamas buferinio tirpalo garavimas, gelis neišdžiūva, garantuojama elektrinė izoliacija [5].

2.15. Kiti elektroforezės metodai

2.15.1. Elektroforezinė chromatografija. Tai popieriaus chromatografijos atmaina. Šios rūšies elektroforeze ne tik atskiriamos krūvį turinčios molekulės, bet ir frakcionuojamos įvairios ląstelės, ląstelinės organelos, membranų fragmentai.

Bandinys, ištirpintas buferiniame tirpale, tolydžiai lašinamas (0.2 cm³/h) ant stataus chromatografinio popieriaus lapo. Pagautas tekančio buferinio tirpalo, jis kartu su juo leidžiasi žemyn. Krūvį turinčios dalelės taip pat juda elektrinio lauko jėgų kryptimi: mišinio komponentai atsiskiria. Atskirtos medžiagos surenkamos mėgintuvėliuose, kurie išdėstyti apatinėje dantytoje chromatografinio popieriaus dalyje. Elektroforezė trunka iki 2 parų.

2.15.2. Laipsninė elektroforezė. Šioje elektroforezėje nešiklis – gelis. Tačiau, skirtingai nuo kitų gelelektroforezės rūšių, čia viename vamzdelyje vartojami įvairaus akučių skersmens geliai, taip pat įvairios sudėties ir pH verčių buferiniai tirpalai. Viršutinę 1/3 dalį gelio stulpelio sudaro didelio akučių skersmens gelis (pavyzdžiui, 5% poliakrilamido gelis); tai vadinamasis koncentruojantysis gelis. Jame stambiosios molekulės juda laisvai, t. y., baltymų molekulių judrumas panašus į buferinio tirpalo jonų judrumą. Apatinė gelio stulpelio dalis – mažo akučių skersmens gelis (7.5% poliakrilamido gelis), vadinamasis darbinis, arba skiriamasis, gelis. Darbo pradžioje buferiniu tirpalu pripildomas apatinis indas, ant gelio užpilamas tiriamasis bandinys. Pripildžius buferinio tirpalo viršutinį indą, įjungiama srovė ir pradedama elektroforezė. Buferiniai tirpalai parenkami taip, kad atskiriamųjų medžiagų krūvis juose būtų neigiamas. Tekėdama per koncentruojantįjį gelį tiriamoji medžiaga koncentruojama siauroje zonoje, skiriančioje koncentruojantįjį ir skiriamąjį gelį. Skiriamasis gelis atskiria medžiagas kaip molekuliniai sietai.

Laipsninei elektroforezei naudojama 10 mA srovė vienam darbiniam vamzdeliui. Elektroforezė trunka apie 1 valandą.

2.15.3. Aukštosios įtampos elektroforezė. Atskiriant mažos molekulinės masės medžiagas chromatografiniame popieriuje bei naudojant žemąją įtampą, esti gana didelė difuzija. Šio analizei trukdančio reiškinio galima išvengti naudojant aukštąją įtampą. Kartu pagerėja skiriamoji geba, o atskiriama labai sparčiai – per 10 – 60 min. Tam naudojami iki 10000 V įtampos maitinimo šaltiniai. Srovės stipris būna iki 500 mA, potencialo gradientas – iki 200 V/cm
Naudojant elektroforezei aukštąją įtampą, išsiskiria labai daug šilumos, todėl reikalinga efektyvi šaldymo sistema. Šaldymui suvartojama 10 – 15 dm³/min vandens. Būtina stebėti, kad šaldymo kamerose nesusidarytų temperatūros gradientas, nes 1 °C temperatūros skirtumas sukelia 3% migracijos greičio pokytį. Dėl to pablogėja rezultatų pasikartojamumas.
Tiriant baltymų hidrolizatus, dažnai po aukštosios įtampos elektroforezės chromatografuojama: šiuo atveju tirpiklio judėjimo kryptis statmena elektroforezės krypčiai [5].

2.16. Metodo taikymas

Svarbiausia elektroforezės taikymo sritis yra biopolimerų tirpalų analizė. Žemosios įtampos popieriaus elektroforeze atskiriamos aminorūgštys, peptidai, baltymai, nukleotidai, nukleorūgštys ir kitos medžiagos. Baltymai, kaip amfoteriniai polielektrolitai, turi savąjį krūvį, kuris priklauso nuo terpės pH. Reguliuojant pH, elektroforezės metu galima ne tik keisti jų judrumą, bet ir judėjimo kryptį. Kiekvienam baltymui būdingas izoelektrinis taškas. Izoelektrinės būsenos baltymo dalelės elektriniame lauke nejuda, o jo tirpumas yra mažiausias. Todėl parinkus tinkamą buferinį tirpalą galima nustatyti reikiamą medžiagų judėjimo greitį ir tirpumą, kartu panaudoti elektroforezę įvairioms medžiagoms atskirti.

Elektroforeze, vartojant nešikliu celiuliozės acetatą, atskiriami kraujo plazmos baltymai ir hemoglobinai. Aukštosios įtampos popieriaus elektroforezė bei plonasluoksnė elektroforezė naudojama kraujyje, šlapime esančioms aminorūgštims atskirti. Ypač svarbi plonasluoksnė elektroforezė, kuri taikoma mažoms molekulėms atskirti, pavyzdžiui, aminorūgštims ir nukleotidams; šis metodas yra pakankamai spartus, esti gera skiriamoji geba.

Elektroforezės pritaikymą labai padidina geliai. Keičiant gelio akytumą, galima labai pagerinti panašaus krūvio, bet skirtingų matmenų ir (arba) formos molekulių atskyrimą, todėl gelelektroforezė – labai patogus metodas nukleorūgščių mišiniams (ypač RNR molekulėms) ir baltymams (tarp jų fermentams, izofermentams ir kt.) atskirti. Elektroforeze atskirtiems junginiams atpažinti gali būti naudojamos sudėtingos optinės sistemos; taip gaunamos elektroforegramos – kreivės su atskiromis smailėmis [5].

3. EKSPERIMENTINĖ DALIS

3.1. Elektroforezės metodika

Buvo analizuojamas gliukozės dehidrogenazės (GDH) baltymas išskirtas iš mikroorganizmų, išaugintų molekulinės mikroboilogojos technologijos skyriuje. Duoto baltymo molekulinės masės nustatymui, taip pat jo grynumo nustatymui buvo naudojamas elektroforezės metodas denaturuojančiomis sąlygomis poliakrilamidiniame gelyje.

Buvo analizuojami 5 gliukozės dehidrogenazės baltymo pavyzdžiai, kurie sąlyginai pažimėti:

A – beląstelinis gliukozės dehidrogenazės baltymas (nevalytas);

B – gliukozės dehidrogenazės baltymas praleistas pro 1 valymo kolonėlę, užpildytą sorbentu B;

C – gliukozės dehidrogenazės baltymas praleistas pro 2 valymo kolonėlę, užpildytą sorbentu C;

D – gliukozės dehidrogenazės baltymas praleistas pro 3 valymo kolonėlę, užpildytą sorbentu D;

E – gliukozės dehidrogenazės baltymas praleistas pro 4 valymo kolonėlę, užpildytą sorbentuE.

Reikia pažymeti, kad sorbentų B, C, D ir E, kuriais buvo užpildytos baltymo valymo kolonėlės sudėtis ir gavimo sąlygos yra konfidencialus reikalas, t. y., man nežinomos.
Minėti 5 pavyzdžiai buna analizujami pagal metodiką pateikiamą žemiau.
3.1.1. Tirpalų ruošimas

Elektroforezei atlikti buvo naudojami anksčiau laboratorijoje pagaminti tirpalai. Jų galiojimo laikas 1 mėnuo. Tirpalai ir reagantai NaSD – poliakrilamidinei forezei buvo pagaminti taip:
1. AA 40% (akrilamidas). Imama 38,93 g akrilamido (C3H5NO), 1,0666 g N,N’ – metilen – bis – akrilamido (C7H10N2O2) ir 100 ml distiliuoto vandens.
2. NaSD – Lauril sulfatas (SDS) [H(CH2)12]2SO4.
3. Buferiai:
• 1,5M TRIS, pH = 8,8. Imama 18,16 g TRIZMA BAZE (C4H11NO3), 100 ml distiliuoto vandens ir su druskos rūgštimi (HCl) gaunama pH = 8,8. Šis buferis vadinamas skirstomuoju.
• 0,5M TRIS pH = 6,8. Imama 6,054 g TRIZMA BAZE (C4H11NO3), 100 ml distiliuoto vandens ir su druskos rūgštimi gaunama pH = 6,8. Šis buferis vadinamas koncentruojamuoju.
• Elektroforezės buferiui pagaminti imama: 15,14 g TRIZMA BAZE (C4H11NO3), 72,07 g glicino (C2H5NO2) ir 1 g SDS (Lauril sulfatas), ir 1000 ml distiliuoto vandens.
4. TEMED (N,N,N′,N′ – tetrametiletilendiaminas), [(CH3)2NCH2]2.
5. APS (amonio persulfatas). Imama 150 g amonio persulfato (NH4)2S2O8) ir 1,5 ml distiliuoto vandens.
3.1.2. Dažai
Elektroforezei atlikti naudojami SDS dažai, kurie yra perkami iš UAB “Grida” firmos.
• SDS dažas. Imama 23 g SDS, 80 μl glicerolio (C3H8O3), 0,5 mg bromfenolio mėlynojo ir 60 mM TRIS buferio, kurio pH = 8.
• Standartinis dažas. Imama 40 ml metanolio (CH3OH),10 ml acto rūgšties (CH3COOH), 0,1 CBB – R – 250 dažo ir 100 ml distiliuoto vandens.
Elektroforezei dar naudojami: markeris “Fermentas” firmos, Protein Molekular Weight Marke SM 0431; tirpalas gelio atplovimui. Tirpalui imama 10 ml acto rūgšties (CH3COOH), 2,5 ml metanolio (CH3OH) ir 100 ml distiliuoto vandens.
3.1.3. Elektroforezės atlikimas

Nustatant baltymo molekulinę masę buvo naudojamas elektrogonezės metodas denaturuojančiomis sąlygomis poliakrilamidiniame gelyje. Eksperimentui buvo imami 5 gliukozės dehidrogenazės (GDH) pavyzdžiai.
2 lentelė
Eil. №
Pavyzdžiai Baltymo koncentracija,
mg/ml
1.
2.
3.
4.
5. A
B
C
D
E 3,36
3,0
1,8
1,6
1,86

Optimalus baltymo kiekis, reikalingas elektroforezei, apskaičiuojamas pagal formulę:

X = 0,04 mg / baltymo kiekis, mg/ml * 1000;

kur: X – eksperimentui naudojamo baltymo kiekis, μl

Apskaičiuojamas kiekviename paimtame analizei pavyzdyje baltymo kiekis:

1. A = 0,04 / 3,36 * 1000 = 11,9 μl
2. B = 0,04 / 3,0 * 1000 = 13,3 μl
3. C = 0,04 / 1,8 * 1000 = 22,2 μl

4. D = 0,04 / 1,6 * 1000 = 25 μl

5. E = 0,04 / 1,86 * 1000 = 21,5 μl

Į kiekvieną pavyzdį yra dedama SDS dažo tiek, kad 1 μl nešamo baltymo reikia 0,33 μl SDS dažo:
1. A = 0,33 * 11,9 = 3,9 μl
2. B = 0,33 * 13,3 = 4,4 μl

3. C = 0,33 * 22,2 = 7,3 μl
4. D = 0,33 * 25 = 8,3 μl

5. E = 0,33 * 21,5 = 7,1 μl

Eksperimentui atlikti reikalingi 6 vienkartiniai ependorfiniai mėgintuvėliai. Į 5 mėgintuvėlius dozatoriaus pagalba (9 pav.) įpilami skirtas elektroforezei baltymas ir dažas. Į 6 mėgintuvėlį pilamas standartinis baltymų mišinys su žinoma molekuline mase (markeris).

9 pav. Dozatoriai

Visi šeši ependorfiniai mėgintuvėliai, su paruoštais baltymo ir markerio pavyzdžiais, yra virinami vandens vonioje 5 – 10 minučių. Po virinimo pavyzdžiai centrifuguojami (centrifuga “Eppendorf” firmos, skirta būtent ependorfiniams mėgintuvėliams) 1 minutę.
Surenkamas rėmelis gelio užpylimui. Jis susideda iš dviejų paprastų stiklų (3 mm pločio), trijų tarpinių ir trijų priveržtinių gnybtų. Visos šios dalys laikomos specialioje dežutėje. Prieš surenkant rėmelį stiklai gerai išplaunami, nuvalomi spiritu ir nusausinami filtriniu popieriumi. Tarp stiklų kraštų dedamos tarpinės ir stiklai suspaudžiami priveržtiniais gnybtais. Kai rėmelis surenktas, gaminami geliai.

10 pav. Rėmelis gelio užpylomui

Skirstomasis gelis
Imama: 1. 20 mg SDS medžiagos,

2. 6 ml AA 40% tirpalo,

3. 5 ml skirstomojo buferio 1,5 M TRIS pH = 8,8,

4. 9,8 ml distiliuoto vandens.
Bendras tūris 20 ml.

Prieš pat pilant skirstomojo gelio tirpalą į paruoštą elektroforezei rėmelį, pridedama 15 μl TEMED ir 200 μl APS. Ant užpilto į rėmelį gelio tirpalo pilamas distiliuotas vanduo (iki pat viršaus). Tuo metu kol sustings skirstomasis gelis ruošiamas antras, koncentruojamasis gelis.

Koncentruojamasis gelis

Imama: 1. 10 mg SDS medžiagos,

2. 2,5 ml koncentruojamojo 0,5 M TRIS buferio pH = 6,8,

3. 1,125 ml AA 40% tirpalo,

4. 6,275 ml distiliuoto vandens.
Bendras tūris 10 ml.
Prieš pat pilant koncentruojamojo gelio tirpalą, į mėgintuvėlį pridedama 100 μl APS ir 15 μl TEMED. Koncentruojamasis gelis pilamas ant viršaus jau sustingusio skirstomojo gelio. Įdedamos specialios šukos, kad susidarytų takeliai.
Surenkamas elektroforezės aparatas, kurį sudaro: stovas, rėmelis su užpiltais geliais, elektroforezės buferis ir du elektrodai, teigiamas (anodas) ir neigiamas (katodas). Po kurio laiko, surinkus elektroforezės aparatą ir jį užpylus elektroforeziniu buferiu, išimamos šukos. Dozatoriaus pagalba į kiekvieną atskirą takelį nešami paruošti baltymo pavyzdžiai. Baigus nešti pavyzdžius elektroforezės aparatas yra prijungiamas prie maitinimo bloko – srovės arba įtampos šaltinio PEFA–1. Maitinimo blokas užtikrina stabilizuotą srovę arba stabilizuotą įtampą. Bandimo metu buvo naudojama pastovi srovė. Po kurio laiko, kai tiriamas baltymas pereina koncentruojamąjį gelį, elektros srovė didinama iki 40 mA, o kai tiriamas baltymas pereina ir skirstojamąjį gelį, srovė atjungiama. Elektroforezė vyksta apie 2 val. (11 pav.) Tuomet išrenkamas elektroforezės aparatas, išimamas gelis ir dedamas į indą su standartiniu dažu (12 pav.). Gelis dažomas apie 1 val. Po dažymo gelis plaunamas specialiame tirpale kelis kartus iki pat gelio atplovimo. Po to gelis yra džiovinamas. Džiovinimui naudojamas celofanas išmirkytas distiliuotame vandenyje. Gelis yra padedamas tarp dviejų celofano lapų ir džiovinamas specialiame džiovinimo prietaise. Tan buvo naudojamas Bio – rad 583 prietaisas, kuriame džiovinimas vykdomas karštu būdu, esant 89 ºC, ir trunka dvi valandas.

11 pav. Elektroforezė

12 pav. Gelio dažymas

3.1.4. Rezultatų apibendrinimas

Išdžiovintas gelis su išryškintų 5 gliukozės dehidrogenazės baltymo pavyzdžių elektroforezės nuotrauka yra parodytas 13 paveiksle. Kairėje nuotraukos pusėje pavaizduota standartinio baltymų mišinio su žinoma molekuline mase (markeris) elektroforezės juosta, kurios duomenys yra lyginami su standartine skale, kuri pateikta 14 paveiksle. Išanalizavus elektroforezės metu išfrakcionuotų 5 mėginių gelį nustatyta, kad apitikrė gliukozės dehidrogenazės baltymo molekulinė masė Mr = 45 kDa. Čia: 1 kDa (kilo Daltonas) = 1000 Da

1 Da = 1,67 * 10 g (1 H atomo masė).
13 paveiksle pateiktoje nuotraukoje matome, kad mėginyje A (nevalytas beląstelinis gliukozės dehidrogenazės baltymas) be pagrindinio baltymo taip pat buvo mažesnės molekulinės masės baltymų priemaišų, o mėginyje B (gliukozės dehidrogenazės baltymas praleistas pro 1 valymo kolonėlę, užpildytą sorbentu B) minėtas baltymas yra pats gryniausias.

Diplominį darbą dariau mokslinio tyrimo Institute, kuriame mokslininkai išskirtus, išgrynintus baltymus panaudoja įvairėms moksliniams tikslams.

Mano atlikto eksperimento duomenimis gliukozės dehidrogenazės baltymo valymui geriausiai tinka valymo kolonėlė, užpildyta sorbentu B.

13 pav. Elektroforezės nuotrauka 14 pav. Standartinė baltymo skalė

4. EKONOMINIAI SKAIČIAVIMAI

Rengiant diplominį darbą buvo pasirinkta elektroforezės analizė.
Ekonominių skaičiavimų tikslas – apskaičiuoti minėtos analizės išlaidas.

4.1. Ilgalaikių investicijų apskaičiavimas

Patalpų plotas 14 m².

Patalpų nusidėvėjimo išlaidos tenkančios vienai analizei, sudaro 0,01 – 0,30 Lt. Imama 0,10 Lt.

Įrangos bei inventoriaus nusidėvėjimo išlaidos, tenkančios vienai analizei, sudaro 0,5 – 3,0 Lt. Imama 1,0 Lt.

4.2. Medžiagų ir energetinių išteklių vertės apskaičiavimas

4.2.1. Medžiagų vertė
1 lentelė
Medžiagų kiekis ir vertė
Medžiagų
pavadinimas Medžiagų kiekis
vienai analizei, vnt. Medžiagų vieneto kaina, Lt Medžiagų
vertė,Lt
1. Skirstomasis gelis:
SDS
Buferinis tirpalas
Akrilamidas
Temed
Amonio persulfatas
Distiliuotas vanduo

2. Koncentrojamasis gelis:
SDS
Buferinis tirpalas
Akrilamidas
Temed
Amonio persunfatas
Distiliuotas vanduo
20 mg
5 ml
5 ml
10 μl
200 μl
9,8 ml

10 mg
2,5 ml
1,125 ml
10 μl
100 μl
6,275 ml
0,14
0,20
0,22
0,0012
0,02
0,0014

0,14
0,20
0,22
0,0012
0,02
0,0014
2,80
1,00
1,10
0,01
4,00
0,01

1,40
0,50
0,25
0,01
2,00
0,01
Iš viso: 13,09

Medžiagos analizei aprašytos eksperimentinėje dalyje, o medžiagų kiekis apskaičiuotas remiantis praktine patirtimi.

Akrilamido vertė apskaičiuojama medžiagų kiekį vienai analizei padauginus iš medžiagų vieneto kainos:
5 * 0,22 = 1,10 Lt

Analogiškai apskaičiuojama kitų medžiagų vertė.

4.2.2. Vandens kiekis ir vertė

Analizei naudojamas vanduo. Jo kiekis ir vertė apskaičiuojami:
0,005 m³ * 4,12 Lt = 0,02 Lt

Prie gautos sumos pridedama buitinio vandens vertės dalis, tenkanti vienai analizei (0,02 – 0,06Lt).

Vandens vertė, tenkanti elektroforezei, lygi:
0,02 + 0,04 = 0,06 Lt

4.2.3 Elektros energijos kiekis ir vertė

Elektros energija naudojama įrangai ir apšvietimui.

Technologinės elektros energijos kiekis apskaičiuojamas atsižvelgiant į tai, kiek laiko analizei yra įjungta įranga ir kiek elektros energijos jis sunaudoja per valandą.

1. Centrifuga
1 * 0,18 kW * 0,02 = 0,004 kWh

2. Elektroforezės aparatas
1 * 0,1 kW * 1,5 = 0,15 kWh

Iš viso: 0,154kWh

0,154 kWh * 0,29 = 0,04 Lt

Apšvietimui elektros energijos kiekis apskaičiuojamas:
14 m² * 18 W * 440 = 110880 Wh = 110,88 kWh

Apšvietimui reikalingos elektros energijos vertė lygi:
110,88 * 0,29 = 32,16 Lt

Apšvietimui elektros energijos vertė, tenkanti vienai analizei, apskaičiuojama nuo elektros energijos apšvietimui vertė imant 0,01 – 0,04%:
32,16 * 0,02 / 100 = 0,01 Lt

Elektros energijos išlaidos elektroforezei lygios:
0,04 + 0,01 = 0,05 Lt

4.3. Darbo užmokesčio apskaičiavimas

Darbo užmokesčio dalis, tenkanti vienai analizei, apskaičiuojama laboranto mėnesinį darbo užmokestį padalinus iš metinio vidutinio mėnesio darbo dienų skaičiaus ir iš darbo valandų skaičiaus per dieną.
450 / 21,1 / 8 val. = 2,66 Lt

Analizė trunka 6 valandas:
6 val. * 2,66 = 15,96 Lt

Nuo darbo užmokesčio vienai analizei sumos būtina apskaičiuoti socialinio draudimo įmokas (31%):
15,96 * 31 / 100 = 4,95 Lt

4.4. Išlaidų apskaičiavimas

2 lentelė
Elektroforezės išlaidos
Išlaidų pavadinimas Išlaidos, Lt
1. Medžiagų vertė
2. Vandens vertė
3. Elektros energijos vertė
4. Laboranto darbo užmokestis
5. Socialinio draudimo įmokos
6. Patalpų nusidėvėjimo išlaidos
7. Irangos bei inventoriaus nusidėvėjimo išlaidos 13,09
0,06
0,05
15,96
4,95
0,10
1,00
8. Kitos išlaidos (iki 5%) 1,06
9. Vienos analizės pilnosios išlaidos (kaštai) 36,27

Kitos išlaidos (kanceliarinės, juridinės paslaugos, turto draudimo, reklamos ir kt.) apskaičiuojamos imant iki 5% nuo visų išlaidų (1 – 7 eilutės) sumos.
35,21 * 3% / 100 = 1,06 Lt
35,21 + 1,06 = 36,27 Lt

4.4.1. Išlaidų struktūros apskaičiavimas

Kiekviena išlaidų rūšis dauginama iš 100% ir dalinama iš vienos analizės pilnųjų išlaidų.

13,09 * 100% / 36,27 = 36,09 % 36,09 * 360 / 100 = 129,92

0,06 * 100% / 36,27 = 0,17% 0,17 * 360 / 100 = 0,61

0,05 * 100% / 36,27 = 0,14% 0,14 * 360 / 100 = 0,50

15,96 * 100% / 36,27 = 44,00% 44,00 * 360 / 100 = 158,40
4,95 * 100% / 36,27 = 13,65% 13,65 * 360 / 100 = 49,14
0,10 * 100% / 36,27 = 0,28% 0,28 * 360 / 100 = 1,01
1,00 * 100% / 36,27 = 2,76% 2,76 * 360 / 100 = 9,94
1,06 * 100% / 36,27 = 2,92% 2,92 * 360 / 100 = 10,51
Iš viso: 100% 360°

Gauti rezultatai parodomi diagramoje.

4.5. Kainos apskaičiavimas

Žinant vienos analizės pilnąsias išlaidas galima apskaičiuoti kainą. Prie analizės pilnųjų išlaidų pridedamas pelnas (pelno procentą nustato pati įmonė) ir PVM (jei įmonė PVM mokėtojas).
36,27 * 20% / 100 = 7,25 Lt
36,27 + 7,25 = 43,52 Lt
43,52 * 18% / 100 = 7,83 Lt
43,52 + 7,83 = 51,35 Lt

5. ŽMOGAUS IR GAMTOS SAUGA

5.2. Darbų saugos instrukcija dirbančiajam laboratorijoje

5.2.1 Bendroji dalis
Darbuotojas privalo:
• laikytis įmonės vidaus darbo tvarkos taisyklių, saugoti savo ir nekenkti kitų darbuotojų sveikatai, mokėti saugiai dirbti;
• žinoti naudojamų cheminių medžiagų ir preparatų fizines, chemines savybes, jų sandėliavimo reikalavimus, taikymo tvarką;
• nedirbti su techniškai netvarkingomis darbo priemonėmis, apie gedimus pranešti darbdaviui arba padalinio vadovui;
• neleisti į savo darbo vietą pašalinių asmenų, neturinčių nieko bendra su pavesta užduotimi.
Draudžiama darbo metu naudoti alkoholinius gėrimus bei narkotines medžiagas, dirbti nesveikuojant ar apsvaigus.
Priešgaisrinės saugos reikalavimai.
• Darbuotojas turi žinoti pavojingų, kenksmingų, nuodingų ir kitų medžiagų savybes, jų pavojingumą gaisro atžvilgiu ir laikytis atitinkamų saugos reikalavimų.
• Laboratorijoje turi būti gaisro gesinimo ir neutralizuojančių priemonių pagal naudojamų medžiagų savybes bei technologinių procesų ypatybes.
• Lengvai užsiliepsnojančius ir degius skysčius laikyti tam tikslui pritaikytose patalpose.
• Draudžiama palikti be priežiūros į elektros tinklą įjungtą aparatūrą ir kitus elektros įrenginius.
Įvykus nelaimingam atsitikimui, būtina nukentėjusiam suteikti pirmąją pagalbą. Reikalui esant, iškviesti greitąją medicinos pagalbą.
Darbo higienos reikalavimai.
• Cheminių medžiagų koncentracija nuolatinių darbo vietų aplinkos ore neturi viršyti higienos normos nustatytų koncentracijų.
• Asmeninės apsaugos priemonės turi būti tvarkingos, naudojamos pagal paskirtį, apsaugos darbo drabužiai švarūs. Draudžiama dėvėti nešvarius, užterštus kenksmingomis, toksiškomis, degiomis ir kt. pavojingomis medžiagomis drabužius.
• Apsaugos darbo drabužiai turi būti skalbiami nustatytais terminais. Griežtai draudžiama nešti į namus nešvarius, užterštus pavojingomis medžiagomis drabužius.
• Darbo vietoje griežtai draudžiama valgyti, gerti, rūkyti. Tai galima daryti tik rūpestingai nusiplovus rankas, praskalavus burną ir tik tam tikslui skirtoje patalpoje.
• Draudžiama patalpose, kur saugomos pavojingos cheminės medžiagos, įrengti sandėlininko darbo stalą.
• Patalpose, kur saugomos cheminės medžiagos, draudžiama lakyti asmeninius daiktus, darbo bei apsaugos drabužius. Draudžiama toje pačioje spintoje laikyti asmeninius rūbus ir apsaugos priemones, maisto produktus.
• Laboratorijoje tam skirtose patalpose turi būti praustuvai, muilas, rankšluosčiai, geriamojo vandens su fontaniniu čiaupu.
• Laboratorijoje turi būti sukomplektuota vaistinėlė, specialus indas arba purkštuvas (pulverizatorius) su vandeniu ar tirpalu akims praplauti.

5.2.2 Reikalavimai keliami laboratorijoms
Laboratorijose laikomos tik griežtai nustatyto pavyzdžio cheminės medžiagos.
Stalų, traukos spintų paviršiai, skirti darbui su gaisro ir sprogimo atžvilgiu pavojingais skysčiais ir medžiagomis, turi būti padengti nedegia medžiaga ir turėti bortelius.
Laboratorijose visi darbai, kurių metu gali išsiskirti kenksmingų, gaisro arba sprogimo atžvilgiu pavojingų dujų bei garų, turi būti atliekami techniškai tvarkingose traukos spintose, veikiant sistemai.
Suslėgtų, suskystintų ir ištirpintų dujų balionus būtina laikyti metalinėse spintose, ne laboratorijoje. Spintos turi būti su vėdinimo angomis arba įrengta padavimo – ištraukimo ventiliacine sistema.
Galeninių preparatų laboratorijose bei patalpose būtina:
• spirito virimo, rektifikavimo aparatus, kompresorius ir karbiuratorinius įrengimus laikyti ne laboratorijos patalpose;
• lengvai užsiliepsnojančius skysčius darbo reikalams tiekti vamzdžiais arba specialia uždaroma tara. Laboratorijoje jų neturi būti daugiau, negu reikia vienai darbo pamainai;
• stikliniai indai su lengvai užsiliepsnojančiais ir degiais skysčiais turi būti laikomi metalinėse dėžėse arba spintose. Didesnės lengvai užsiliepsnojančių medžiagų atsargos laikomos specialiuose sandėliuose;
• lengvai užsiliepsnojančius, degius skysčius, kenksmingas ir nuodingas medžiagas draudžiama pilti į kanalizaciją. Panaudotus lengvai užsiliepsnojančius, degius skysčius būtina supilti į sandarų indą, o pasibaigus darbo dienai – išnešti iš laboratorijos;
• neleidžiama naudoti stiklinių indų benzokarbiuratoriniams įrengimams ir guminių žarnelių dujoms tiekti į degiklius.
Visose laboratorijų patalpose vėdinimo sistema turi būti įjungta 5 min. prieš darbą ir išjungta darbą baigus.

5.2.3 Darbuotojų veiksmai prieš darbo pradžią
Prieš pradedant darbą, apsivilkti tvarkingais darbo drabužiais, naudoti paskirtas asmenines apsaugos priemones.
Darbo vietoje neturi būti pašalinių daiktų.
Paruošti darbo vietą. Kai sintetinami ir tiriami nauji junginiai, kiekvienai laboratorijai parengiamos saugos darbo instrukcijos, atsižvelgiant į specifinius pavojus.
Visi laboratorijų darbuotojai papildomai instruktuojami, kai pradedami nauji darbai.
Išbandyti aparatūrą ir parengti būtinas saugos darbo priemones.
Parengti bandymų technologines schemas.
Patikrinti:
• elektros prietaisų, slėginių indų, autoklavų ir kitų prietaisų, kuriais aprūpinta darbo vieta, tvarkingumą;
• ar efektyviai veikia traukos sistema;
• ar neužkrauti praėjimai.
Draudžiama pačiam remontuoti elektros įrenginių skydelius, pultus, prietaisus ir pan., neturint elektrotechniniam personalui privalomos kvalifikacijos.
Apie pastebėtus trūkumus informuoti įmonės (laboratorijos) vadovą.

5.2.4 Darbuotojo veiksmai darbo metu
Dirbant su nepakankamai ištirtomis ar nežinomos sudėties medžiagomis, negalima nustatyti medžiagos tapatybės pagal jos kvapą ar skonį. Esant būtinumui, medžiagos kvapą iš indo link nosies reikia nukreipti plaštakos judesiu. Draudžiama įsiurbti skystį į pipetę su burna (būtina tai atlikti tam skirta kriauše).
Dirbti pavojingus darbus leidžiama ne mažiau kaip dviem žmonėms.
Darbo vietoje palaikyti švarą ir tvarką.
Neatidarinėti įrengimų ir mechanizmų elektros paskirstymo spinų, skydelių.
Naudotis prietaisais, aparatais gali tik apmokytas darbuotojas.
Draudžiama dirbti su netvarkingais prietaisais ir įrengimais.
Valyti prietaisus ir įrengimus galima tik išjungus juos iš elektros tinklo.
Eksploatuojant prietaisus ir aparatus, būtina vadovautis jų eksploatavimo instrukcijose išdėstytais reikalavimais.
Draudžiama pilti chemines medžiagas į kanalizaciją, vandens telkinius, buitinių atliekų konteinerius.
Išsiliejusias ar išbirusias chemines medžiagas būtina nedelsiant surinkti ir/ar nukenksminti. Renkant išpiltas ir išbarstytas chemines medžiagas, būtina vadovautis saugos duomenų lapo nurodymais.
Sandėliuose turi būti sorbuojančių ir neutralizuojančių medžiagų, skirtų pavojingoms medžiagoms surinkti ir neutralizuoti.
Renkant ir/ar neutralizuojant chemines medžiagas, privaloma naudotis asmeninėmis apsaugos priemonėmis.
Surinktos išbarstytos kietosios cheminės medžiagos, užterštos sorbuojančios medžiagos, panaudoti neutralizuojančių medžiagų likučiai, taip pat kitos sandėlio atliekos: pasenę reagentai, užterštos pakuotės, neidentifikuotos medžiagos ir kt. – turi būti sudedamos į specialius konteinerius arba talpyklas su atitinkamais užrašais ir tvarkomos pagal atliekų tvarkymą reglamentuojančių teisės ir normatyvinių aktų reikalavimus. Surinkus neutralizuotus skysčius draudžiama išpilti į kanalizaciją, jie turi būti tvarkomi pagal nuotėkų tvarkymą reglamentuojančių teisės aktų reikalavimus.
Negalima laikyti cheminių medžiagų arti šildymo įrenginių. Lentynos, kuriose laikomos cheminės medžiagos, ir rietuvės nuo šildymo įrenginių turi būti ne arčiau kaip per 1 min.
Skystos cheminės medžiagos 10 l ir didesnės talpos buteliuose turi būti laikomos pintinėse.
Metalinės, stiklinės ar kitos taros degazacija galima tik specialioje patalpoje arba aikštelėje.

5.2.5 Cheminių medžiagų neutralizavimas
Rūgščių neutralizavimas:
 išsiliejusią rūgštį reikia užpilti smėliu, po to smėlį sušluoti medine ar plastmasine šluota;
 vietą, kurioje išsipylė rūgštis, užberti kalkėmis arba soda, po to praplauti vandeniu.
Šarmų neutralizavimas:
 koncentruoti šarmų – kalio, natrio, taip pat amoniakinio vandens tirpalai, išsilieję ant grindų, apipilami smėliu arba pjuvenomis;
 nušlavus nuo grindų užterštą smėlį ar pjuvenas, vietą būtina pašluostyti acto rūgšties tirpalu.
Gyvsidabrio ir jo junginių neutralizavimas:
 išsipylęs gyvsidabris kuo skubiau surenkamas į hermetišką emaliuotą, porcelianinį ar stiklinį indą. Gyvsidabris surenkamas gumine kriauše. Žiūrint per padidinamąjį stiklą, patikrinama, ar išsiliejimo vietoje visiškai surinktas gyvsidabris. Užteršta vieta baigiama valyti šluotele, sumirkytą 0,1 kalio permanganato ir druskos rūgšties (į 1 litrą vandens įpilti 5 ml koncentruotos druskos rūgšties) tirpalu;
 gyvsidabrio junginiai gali būti neutralizuojami vienu iš šių būdų:
 20 geležies (III) chlorido tirpalu;
 10 kalio permanganato su druskos rūgštimi (5 ml HCl 1 litre vandens) tirpalu;
 demerkurizacija vykdoma vadovaujantis higienos norma 2.15. HN 68-1996.
Kitų cheminių medžiagų neutralizavimas:
 chromo anhidridas (chromo trioksidas), fenolis, akumuliatorinė rūgštis, monochloracto rūgštis, skruzdžių rūgštis, švino nitratas, sidabro nitratas, ortofosforo, sieros, azoto ir kitų neorganinių rūgščių druskos, stibio trichloridas, acto ir rūgštynių rūgštis gali būti neutralizuojami 20 geriamosios sodos (natrio bikarbonato) tirpalu;
 amoniakinis vanduo, kalio hidroksidas, natrio hidroksidas gali būti neutralizuojami 5 acto rūgšties tirpalu;
 kalio nitratas, kalcio nitratas, natrio nitratas, kalio peroksidas, vandenilio peroksidas, kalio bromidas, kalio chloridas, kalcio chloridas, cinko chloridas neutralizuojami vandeniu;
 bertoleto druska, kalio permanganatas, kalio perchloratas gali būti neutralizuojami taip:
 kietos medžiagos surenkamos į tam skirtą konteinerį, medžiagų tirpalai užpilami smėliu ir šis vėliau surenkamas, kietos bertoleto druskos negalima maišyti su kitomis medžiagomis; visoms šios grupės išpiltoms oksiduojančioms medžiagoms neutralizuoti draudžiama naudoti degiąsias medžiagas;
 užteršta vieta užpilama rūgščiu geležies sulfatu (10 g geležies sulfato ir 2 ml sieros rūgšties 100 ml vandens); šio tirpalo nenuplauti 5 min.;
 pašalinamas sorbentas;
 paviršius apdorojamas 20 sodos tirpalu, pakartotinai jį užpilant kas minutę, kol nebekyla burbuliukai; šio tirpalo nenuplauti 5 min.;
 neutralizacijos atliekos nuplaunamos vandeniu;
 tetrachloracetilenas (tetrachloretanas) neutralizuojamas pagal tokią schemą:
 išpylimo vieta užpilama smėliu arba kita inertine absorbuojančia medžiaga ir gautas mišinys surenkamas į konteinerį, kuris vėliau laikomas saugioje vietoje;
 išpiltam ant paviršiaus cheminiam agentui ištirpinti naudojamas etanolis (etilo alkoholis);
 etanolis pašalinamas užpylus jį smėliu arba granuliuotu absorbuojančiu moliu, kuris vėliau surenkamas;
 galutiniam neutralizavimui gali būti panaudotas 20 sodos tirpalas, kuriuo užpilama vieta, iki dingsta burbuliukai;
 paviršiuje sodos tirpalas paliekamas dar 5 min.;
 plovimas vandeniu;
 bromas gali būti neutralizuojamas taip: išpiltas skystis surenkamas į sandariai uždaromą konteinerį, pažeista vieta neutralizuojama tirpalu, kuris gaunamas 4 kg natrio sulfido ir 115 g sodos ištirpinus 10 l vandens, arba mišiniu, kuriame yra 1 tūris amoniakinio vandens (25), 1 tūris terpentino ir 10 tūrių etanolio (96);
 formaldehidas (skruzdžių aldehidas) neutralizuojamas nuplaunant jį amoniakinio vandens tirpalu;
 chloro rūgštis neutralizuojama taip:
 reikiama vieta apiberiama sorbuojančia medžiaga, užteršta sorbuojanti medžiaga surenkama į sandariai uždaromą konteinerį; draudžiama naudoti pjuvenas ir kitas degiąsias medžiagas;
 gerai nuplaunama vandeniu.

5.2.6 Darbuotojo veiksmai baigus darbą
Sutvarkyti savo darbo vietą.
Rankas nusiplauti šiltu vandeniu su muilu.
Įsitikinti, ar naudotos pavojingos, kenksmingos, nuodingos ir kitos medžiagos tvarkingai sužymėtos, sudėtos į joms skirtas vietas ir atitinkamai apsaugotos nuo pašalinių ar atsitiktinių asmenų.
Apie darbo metu pastebėtus saugos darbo taisyklių pažeidimus, prietaisų ir įrengimų gedimus informuoti padalinio vadovą arba darbdavį.

Leave a Comment