TURINYS
1. Įvadas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22. Skysčių chromatografijos metodas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32.1. Skysčių chromatografijos tipai. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32.2. Jonų mainų chromatografija. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42.3. Ekskliuzioninę chromatografija. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42.4. Afininė arba biospecifinė chromatografija. . . . . . . . . . . . . . . . . 43. Fermentų išskyrimas ir valymas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53.1. Darbo su fermentais bendri principai. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73.2. Fermento ekstrakcija, valymas ir analizė. . . . . . . . . . . . . . . . . . 74. Išvados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95. Literatūros sąrašas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101. Įvadas.Vienas iš aktualiausių dabartinės analizinės chemijos uždavinių yra naujų, efektyvesnių metodų taikymas, tam kad galima būtų analizuoti sudėtingų junginių bet kokios sudėties mišinius. Jei naudojami tik kai kurie metodai, nei viena laboratorija negalės atlikti didelio kiekio įvairiausių tyrimų.Chromatografinė analizė – fiziko cheminis daugiakomponenčių sistemų atskyrimo ir analizės metodas remiasi selektyviu medžiagų molekulių ir jonų sugėrimu iš tirpalų bei dujų, naudojant kietus bei skystus sorbentus. Chromatografinė analizė remiasi sorbcijos reiškiniais (dujų ar ištirpusių medžiagų sugėrimas kietais ar skystais sorbentais, ”sorbio” lot. kalb. – sugerti, įtraukti). Chromatografiškai atskiriant ir analizuojant medžiagas naudojama adsorbcija, jonų mainai, mišinio komponentų perskirstymas tarp nesimaišančių skystų fazių, laipsninio nuosėdų susidarymo ir nevienodo jų tirpumo. Taip pat laipsninio kompleksinių junginių susidarymo ir įvairių kitų reiškinių, kurie sąlygoja įvairias chromatografijos rūšis.Beveik visos cheminės reakcijos vyksta organizme, dalyvaujant biologiniams katalizatoriams. Jei ląstelėse šių katalizatorių nebūtų, tai cheminės reakcijos vyktų labai lėtai arba visai nevyktų. Dauguma biologinių katalizatorių yra baltymai, vadinami fermentais. Cheminės reakcijos, vykstančios organizme, greitis priklauso nuo fermento tipo ir jo savybių. Fermentų randama visų audinių ląstelėse. Jie specifiškai veikia biochemines medžiagų apykaitos reakcijas.Fermentus galima analizuoti įvairių metodų pagalba. Labai efektyvūs dažniausiai taikomi metodai – skysčių chromatografija bei elektroforezė. Šiame darbe mes apibūdinsime labai efektyvių skysčių chromatografijos metodų (o būtent jonų mainų chromatografijos) taikymą fermentams atskirti ir aptikti.2. Skysčių chromatografijos metodas.Labai efektyvi skysčių chromatografija (LESC) – labiausiai perspektyvus skysčių chromatografijos metodas, plačiai naudojamas medicinoje ir biochemijos analizės metu. Metodas leidžia greitai atlikti analizę, yra tikslus ir jautrus. Perskyrimas įvyksta kai analizuojamo mišinio komponentai skirtingai reaguoja su nejudria chromatografinės kolonėles faze bei eliuentu. Kiekvieno junginio išeiga fiksuojama detektoriaus pagalba. LESC panaudojimas neleidžia junginiams suskilti analizės metu.
Jonų mainų chromatografija yra viena iš LESC modifikacijų, leidžia perskirti jonus, o ekskliuzioninė chromatografija – aukštos molekulinės masės junginius. Perskyrimo laipsnį nulemia sorbento selektyvumas ir sorbcijos laipsnis.2.1. Skysčių chromatografijos tipai.Skysčių chromatografija būna skysčių-adsorbcijos (junginiai atskiriami pagal jų savybę adsorbuotis ir desorbuotis adsorbento paviršiuje), skysčių-skysčių arba pasiskirstymo (atskyrimas vyksta dėl skirtingo tirpumo judrioje fazėje eliuente ir nejudrioje fazėje), jonų mainų chromatografija, kur atskyrimas įvyksta kai medžiagų joninės grupės grįžtamai reaguoja su sorbento (jonito) grupėmis. Jonų mainų chromatografija plačiai naudojama prieš-bakterinių vaistų gamyboje.Jonų mainų chromatografijos pagrindas yra klasikinės jonų ekstrakcijos principas. Tam į judriąją fazę pridedama turinčio priešingą krūvį jono, kuris selektyviai sudaro kompleksus su analizuojama medžiaga. Tokios modifikacijos privalumai yra tame, kad kartu galima analizuoti rūgštinės, bazinės bei neutralios prigimties junginius. Parenkant sąlygas būtina numatyti analizuojamos medžiagos molekulinę masę, jų poliškumą ir kitų junginių prigimtį. Jei analizuojamos medžiagos molekulės masė yra daugiau už 2000 s.v., dažniausiai naudoja ekskliuzioninę arba helio chromatografiją. Medicinoje ir biochemijos analizėje dažniausiai naudoja ekskliuzioninę helio-chromatografiją. ir afininį (biospecifinį) metodus.2.2. Jonų mainų chromatografija.Įvairių fermentų mišinių analizė nėra labai sunki ir gali būti atliekama jonų mainų chromatografijos pagalba. Jonų mainų chromatografijos metodai naudojami gana senai, bet iki tam tikro laiko turėjo ribotą praktinį taikymą. Tai paaiškinama tuo, kad eliuentas juda nelabai greitai ir chromatografijos metu tam tikro komponento zona jonų mainų kolonėlėje gali būti neryški. Pastaruoju metu jonų mainų chromatografija įgauna vis didesnę reikšmę. Nors šis terminas plačiai naudojamas, jis nėra labai patogus, nes apibūdina analizės objektą, bet neatitinka chromatografijos metodų klasifikacijai. Pagal šią klasifikaciją visi atskyrimai, kurie įvyksta jonų mainų chromatografijos metu yra būtent jonų chromatografija, esant naujoms proceso vykimo sąlygoms. Jonų mainų chromatografijos esmė, t.y. grįžtami jonų mainai tarp nejudrios (joninės dervos, sorbentas) fazės ir skystos judrios fazės.2.3. Ekskliuzioninė chromatografija.
Šio metodo esmė yra medžiagų mišinio atskyrimas pagal jų molekulines mases. Ekskliuzioninės (anglų “exclusion” – išskyrimas, pašalinimas) chromatografijos metu medžiagos molekulės atskiriamos pagal jų gebą patekti į sorbentą. Judrioji fazė – skystis, nejudrioji – tas pats skystis, užpildęs sorbentą. Jei medžiagos molekulės negali patekti į sorbentą, aišku jos išeis iš kolonėlės greičiau nei ta medžiaga, kurios dydžiai mažesni. Molekulės arba jonai, kurių dydžiai yra tarp didelių ir mažų, pasiskirstys į atskiras zonas.Pastaruoju metu ekskliuzioninę chromatografiją naudoja biopolimerų, peptidų, polisacharidų, fermentų išskyrimui ir valymui.2.4. Afininė arba biospecifinė chromatografija.Ypatingą reikšmę skysčių chromatografijoje turi afininė (biospecifinė) chromatografija (anglų “affinity” – giminingumas). Afininės chromatografijos (ACh) pagrindas yra tas, kad biologiškai aktyvūs junginiai gali specifiškai ir grįžtamai susirišti su kitomis medžiagomis, sudaryti kompleksus. Metodą pirmą kartą panaudotas 1951 m. JAV. Afininės chromatografijos metu biologiškai aktyvūs junginiai reaguoja tik su tam tikru substratu, t.y. vyksta molekulinis atskyrimas. Fermentas atpažįsta savo substratą, antigenas – antikūną, hormonas – receptorių. Vienas fermentas dažniausia katalizuoja tik vieno tipo reakciją, atitinkamo komplekso susidarymas vyksta dėl griežtos medžiagų struktūrų atitikimo tvarkos. Medžiagų atskyrimas ACh pagalba yra sudarytas iš kelių etapų. Chromatografinę kolonėlę užpildo sorbentu, kuris kovalentine jungtimi surištas su kuria nors biologiškai aktyvia medžiaga (afinatas arba ligandas). Plačiausiai naudojami Ach nešikliai yra akarozės granuliuoti heliai, poliakrilamidas (biohelis R), polistirolio dervos su chemiškai aktyviomis grupėmis, celiuliozė ir jos dariniai (pvz., karboksimetilceliuliozė – KMC), neseniai pradėta naudoti chitozano pagrindo sorbentai ir kiti junginiai. Po to analizuojamų medžiagų mišinį praleidžia per kolonėlę. Kolonėlėje absorbuojasi ta medžiaga, kuri turi biologinį suderinamumą su sorbento ligandais. Afinatas sudaro su juo kompleksą. Visi kiti komponentai praeina per kolonėlę. Specifiškai adsorbuotas fermentas gali būti išskirtas iš komplekso pakeitus eliuentą, pH, tirpalo joninę jėgą. Ligandais gali būti įvairūs junginiai: baltymai, peptidai, aminorūgštys, vitaminai, nukleotidai, nukleino rūgštys, angliavandeniai ir didelė gausa kitų junginių.
Ligando imobilizacija nešiklio paviršiuje atliekama anksčiau jo aktyvacijos. Tiesioginis kovalentinis prijungimas vyksta labai retai, ypač kai ligando molekulės nėra didelės. Tai įvyksta kai chemiškai aktyvios nešiklio grupės yra arti viena kitos. Tada ligando susijungimas su nešiklio paviršiumi atliekamas alifatinės grandinėles pagalba (2-10 anglies atomų ilgio). Nešiklio likusios aktyvios grupės blokuojamos naudojant atitinkamus cheminius reagentus. Labiausiai paplitęs nešiklių, turinčių hidroksilo grupių aktyvacijos būdas – tai reakcija su bromcianu šarminėje terpėje (pH ~ 11).3. Fermentų išskyrimas ir valymas.Ilgą laiką buvo manyta, kad fermentai yra baltyminės kilmės medžiagos. XX amžiaus 80-jų metų pradžioje netikėtai buvo atrasta, kad kai kurie žemos molekulinės masės RNK katalizuoja RNK pirmtakų pavertimą į pačią RNK.Nors fermentų laboratorinė sintezė jau egzistuoja, kol kas nenumatoma greito fermentų sintezės paplitimo. Visų pirma fermentų sintezė laboratorijoje yra sudėtingas ir brangus procesas. Dabartiniu metu didžioji dalis visų fermentų išskiriama iš biologinės kilmės objektų. Fermentų išskyrimas mažai kuo skiriasi nuo baltymų išskyrimo. Nors egzistuoja ir specifiniai metodai. Tarp fermentų išskyrimo metodų galima pažymėti ekstrakciją glicerino pagalba (išlieka fermentų natyvinės savybės), taip pat “acetono miltelių” metodas, kai biologiniai audiniai ekstrahuojami ir nuvandeninami ne aukštesnėje kaip -10 temperatūroje. Prie fermentų išskyrimo metodų galima priskirti fermentų gavimą absorbcijos pagalba, išplaunant gautą fermentą iš absorbento. Pirmą kartą šį metodą panaudojo Danilevskis. Šiuo metu fermentų išskyrimo ir išvalymo adsorbcinis metodas yra gerai ištirtas ir plačiai taikomas. Taip pat gana plačiai naudojamas jonų mainų chromatografijos metodas, molekulinių sietų metodas, elektroforezė ir ypatingai izoelektrofokusavimas. Viena adsorbcinio metodo modifikacija yra afininė chromatografija, kai adsorbentas yra tam tikra medžiaga su kuria reaguoja tam tikras fermentas. Tokio metodo pagalba išskiriamas tik vienas tam tikras fermentas.Tam, kad sėkmingai išskirti fermentą iš ląstelių kultūros, reikia kad pradinė medžiaga būtų labai gerai susmulkinta. Ypatingą dėmesį verta skirti analizės sąlygoms tam, kad neįvyktų baltymo denatūracija, nes šiuo atveju fermento aktyvumas labai sumažėja. Tam, kad denatūracija neįvyktų, išskyrimo bei analizės procedūrą atliekama esant priedams. Pvz., NS-* turinčių junginių (cisteinas, glutationas, merkaptoetanolis, cisteaminas, ditiotreitolas ik kt.).Fermento išskyrimo metu laibai svarbu yra palaikyti tinkamą temperatūrą, nes kai kurie fermentai net prie-80 temperatūros netenka savo aktyvumo.Norint nustatyti fermento homogeniškumo laipsnį naudojami įprastiniai baltymų chemijos metodai. 1906 m. Pirmą kartą fermentas buvo gautas kristaliniame pavidale. Neretai fermento grynumo laipsnis tiesiogiai priklauso nuo jo biologinio aktyvumo. Jei aktyvumas (valant toliau) nepadidėja, medžiagą galima laikyti homogenine. Iš 2003 išskirtų fermentų apie 1500 išvalyti ir išskirti, trečdalis užkristalintas. Keli šimtai jų turi pirmines, o keli dešimčiai jų – tretines struktūras.3.1. Bendri darbo su fermentais principai.
Didžioji dalis fermentų yra labilūs baltymai. Ekstrahuojant fermentus reikia atkreipti dėmesį į tai, kad fermentai gali lengvai denatūruotis arba tapti neaktyviais, veikiant išoriniams faktoriams. Todėl fermentų išskyrimo, valymo ir analizės metu reikia laikytis tam tikrų saugos priemonių. Visos operacijos atliekamos 2-4 temperatūroje, pageidautina šaltame kambaryje, frakcionavimas su organiniais tirpikliais turi būti atliekamas žemiau 0 temperatūros.Pradiniame ekstrakte fermentai yra gana stabilūs. Tai galima paaiškinti tuo, kad tirpale yra nemažai ir kitų baltymų. Fermento valymo metu, jo stabilumas mažėja, todėl visą darbą reikia atlikti greitai.Reikia naudoti buferį tam, kad palaikyti pH reikšmę tam tikrame diapazone. PH reikšmės kontrolė atliekama pH-metro pagalba. Fermento išskyrimo metu reikia naudoti ypatingai švarius reagentus maišyti mišinį. Nuosėdos, kurios susidaro frakcionavimo metu atskiriamos nuo tirpalo centrifugos pagalba.3.2. Fermento ekstrakcija, valymas ir analizė.
Prieš kokio nors fermento išskyrimą ir valymą, būtina žinoti šio fermento analizės būdus ir savybes. Fermento išskyrimo darbas pradedamas nuo jo ekstrakcijos iš audinių. Audiniai turi būti tinkamai susmulkinti. Tai galima daryti acetono pagalba. Tam susmulkinti audiniai įdedami į ekstraktorių, užpilami ataušintu acetonu ir homogenizuojami šaltyje (-20 ). Gautas tirpalas greitai filtruojamas vakuumo pagalba. Nuosėdas veikiamos acetonu, vėl nufiltruojamos ir įdedamos į vakuumo-eksikatorių. Gautus miltelius galima saugoti šaldytuve kelius mėnesius.Ekstrakcijai dažniausiai naudojamas koks nors specialiai parinktas buferis. Jei fermentas yra ypač jautrus, ekstrakcija ir fermento valymas vykdomas pridėjus EDTA. Ląstelių ekstraktas kartu su fermentais turi ir kitų medžiagų.Išskiriant fermentą baltymai nusodinami frakcionuojant juos ir keičiant pH. Fermento valymas įvyksta per baltymų nusodinimą (denatūracija). Šiluminė baltymų denatūracija vyksta skirtingoje temperatūroje, kas priklauso nuo baltymo prigimties. Esant švelnioms sąlygoms galima koaguliuoti didesnę dalį baltymų be fermento inaktyvacijos. Baltymai gali būti nusodinti ir druskų tirpalų pagalba. Kambario temperatūroje didžioji dalis fermentų, esant organiniams tirpikliams, inaktyvuojasi. Todėl fermentų frakcionavimas atliekamas žemoje temperatūroje. Kai tirpale yra neorganinių druskų, reikia imti daugiau tirpiklio. Galutinai fermentą galima išvalyti selektyvios adsorbcijos pagalba. Baltymų adsorbavimas ir išplovimas vyksta įvairiose sąlygose. Todėl adsorbcijos metodą galima naudoti fermentų valymui. Skiriama neigiama adsorbcija, kai pridėjus adsorbento fermentas lieka tirpale ir teigiama adsorbcija, kai adsorbuojasi būtent pats fermentas. Optimaliausia adsorbcijos reikšmė kai pH yra 5-6. Kai adsorbuojasi baltymai užtenka tik maišyti tirpalą, po to, kai helis jau pridėtas, kol nesusidarys suspensija. Jei adsorbuojamas fermentas, helio likutis perplaunamas vandeniu arba buferio tirpalu. Fermento išplovimą atlieka kontroliuojant fermento aktyvumą. Tam helio nuosėdos 10-15 min. maišomos su eliuentu ir buferiu, centrifuguojamos ir išmatuojamas skysčio fermentinis aktyvumas. Selektyviosios adsorbcijos pagalba galima sukoncentruoti fermento tirpalą.Didžioji dalis fermentų kristalizuojasi iš amonio sulfato tirpalo. Norint iškristalizuoti fermentą, jis turi būti pakankamai švarus ir tirpale būtų reikiama jo koncentracija. Fermentų grynumo nustatymui, pastaruoju metu, dažniausiai naudojami elektroforezė ir skysčių chromatografija. Heksokinazės nustatymas mielių kultūroje. Prieš pradedant analizę atliekamas fermento išskyrimas. Iš pradžių mielės džiovinamos, vykdomas pH nusodinimas ir frakcionavimas amonio sulfato pagalba. Chromatografija ant karboksimetilceliuliozės (KMC). Sujungiamos dvi fermentinės frakcijos, atliekama dializė prieš acetatinį buferį. KMC paruošiama pagal analizės standartus. Kolonėlė 1,415 cm pripilama buferio (acetatinis buferis pH 5). Į kolonėlę įpilamas baltymo tirpalas. Po to leidžiamas acetatinis buferis (1-2 tūriai tam, kad išplauti nesusijungusius su KMC baltymus). Po to praleidžiamas pH 5,0 buferis, kuriame yra 0-0,4 M NaCl. Eliucijos greitis – 20 ml/val. Frakcijos renkamos po 4 ml.4. Išvados.Chromatografinės analizės metodai pradėti naudoti XX amžiaus pradžioje. Skysčių chromatografijos metodai plačiai taikomi medicinoje ir biologinėje chemijoje. Šis analizės metodas užimą svarbią vietą vaistų gamyboje, hormonų išskyrime, kokybiškai matuojant fermentų ir neuromediatorių kiekius.Skysčių chromatografijos metodo pagalba yra labai patogu atskirti ir analizuoti gamtinės kilmės medžiagas: baltymus, fermentus ir kt. Šiam tikslui naudojamos tokios skysčių chromatografijos modifikacijos, kaip jonų mainų chromatografija. Fermentų analizei labiausiai tinka šios jonų mainų chromatografijos modifikacijos: ekskliuzioninė chromatografija ir afininė chromatografija. Šių chromatografijos metodų pagalba galima ne tik tiksliai nustatyti tam tikro fermento kiekį, bet ir išskirti vieną arba kitą fermentą iš fermentų mišinio, ekstrakto ir kt.Afininės chromatografijos metodas leidžia išskirti vieną fermentą iš jų mišinio. Ekskliuzininės chromatografijos metodas leidžia išvalyti fermentų ekstraktą nuo pašalinių medžiagų bei baltymų.5. Literatūros sąrašas.1) Алленмарк С. Хроматографическое разделение энантиомеров. Москва: Мир, 1991. 268 с. С. 131-132.2) Евгеньева И.И. Планарная хроматография и анализ органических веществ // Соросовский Образовательный Журнал, 1999. № 11. С. 50-55.3) Иголкина Л.А., Руденская Ю.А., Руденская Г.Н. Аффинные сорбенты на основе хитозана для выделения протеолитических ферментов. // Вестник Московского университета., Серия 2, Химия. Т 41, Nr 6. 398-401.4) Карцова А.А. Жижкостная хроматография в медицине. // Соросовский Образовательный Журнал, T 6, Nr 11, 2000. 35-40.5) Орлов В.И., Аратсков А.А. Жидкостная хроматография: теоретические основы. Дзержинск, 1997. – 41. С. 8-10; 38-40.6) Сакодынский К.И., Бражников В.В. Аналитическая хроматография. Москва, 1993. – 464 с. С. 235-238; 289; 326.7) Столяров Б.В., Савинов И.М., Витенберг А.Г., Карцова А.А. Практическая газовая и жидкостная хроматография. СПб.: С.-Петербург, 1998. 610 c. C. 200-202.8) Яшин Я.И., Яшин А.Я. Высокоэффективная жидкостная хроматография: Состояние и перспективы. // Журнал Российского Химического Общества имени Д.И. Менделеева, 2003, XLVII, Nr 1, c. 64-79.