KAI KURIŲ B GRUPĖS VITAMINŲ NUSTATYMAS DIDELIO SLĖGIO SKYSČIŲ (DSS) CHROMATOGRAFIJA.
DSS chromatografija nuo klasikinės skysčių chromatografijos tuo, kad judri fazė paduodama į kolonėlę iš išorinio rezervuaro didelio slėgio siurbliais, naudojamos plieninės kelių milimetrų skersmens kolonėlės, smulki nejudrioji fazė (3 – 10m) [1]. DSS naudojama nelakiems, stipriai poliariems, didelės molėkulinės masės, termolabiliems ir nestabiliems junginiams analizuoti. Pagrindiniai šios analizės privalumai:1. didelis chromatografinis efektyvumas,2. trumpas analizės laikas,3. didelis jautrumas nustatant ir atskiriant labai mažų koncentracijų komponentus.Šie privalumai paskatino pritaikyti DSS chromatografiją ir B grupės vitaminų analizei. Vitaminams nustatyti naudojamos jonų mainų ir jon-porinė atvirkščių fazių chromatografijos. Literatūroje [2] pateikiamos metodikos atskirai kiekvienam vitaminui nustatyti, bet jos turi daug bendrų bruožų: bandinys ruošiamas atliekant silpnai rūgštinę (0,1N HCl) ir/ar fermentinę hidrolizę (papainas), judri fazė sudaryta iš acetonitrilo (ar metanolio), naudojamos atvirkščių fazių chromatografinės kolonėlės C18 , C8 ir kt. Tačiau kiekvieno vitamino nustatymas turi savo ypatybių, kurias sąlygoja vitamino savybės (pvz. B1 amino grupė linkusi prisijungti prie sorbcinės medžiagos (silanolio) jungčių, dėl ko pailgėja sulaikymo kolonėlėje laikas. B2 sulaikymo laikas labai priklauso nuo judrios fazės pH).Yra sukurti metodai ir kompleksiniam vitaminų B1, B2 ir B6 nustatymui. Literatūroje [3] pateikta kiekybinės šių vitaminų analizės kūdikių maiste metodas. Bandinys ekstrahuojamas perchloratorūgštimi, vidinis standartas m – benzenkarboksi rūgštis, judrios fazės sudėtis: vanduo, acetonitrilas, natrio heksanosulfatas.AB “Endokrininiai preparatai”, kur buvo atliekamas tyriamasis darbas gaminamo vitaminų B komplekso kokybei įvertinti pradėto naudoti pagal Britanijos Farmakopėją, paruošta metodika kompleksiniam vitaminų B1, B2, B6 kiekybiniam nustatymui. Atliekama atvirkštinių fazių jon-porinė chromatografija, vidinis standartas – kofeinas, judri fazė sudaryta iš vandens, acetonitrilo, natrio heksanosulfanato ir natrio dihidrofosfato (pH= 2,78). Naudojama atvirkštinių fazių kolonėlė C18, eliucija gradientinė (greitis 2ml/min), detekcija atliekama UV detektoriumi 280nm ilgio banga. Dirbama su didelio slėgio skystiniu chromatografu Waters (JAV).
Įsisavinant metodiką susidurta su eile sunkumų. Panaudota Bondapak C18 kolonėlė buvo nepakankamo selektyvumo (susiliejo tiamino ir kofeino pikai). Chromatografinių sąlygų (eliucijos greitis, gradiento programa) keitimas, vidinio standarto atsisakymas nedavė lauktų rezultatų. Problema buvo išspręsta panaudojus iš karto dvi kolonėles Bondapak C18 ir Vydac C18, Unisfer C18 kolonėlę.KTU Organinės chemijos katedroje atlikti eksperimentai su LiChrospher C18 kolonėle taip pat davė teigiamus rezultatus.Siekiant įsitikinti aparatūros veikimo tikslumu, metodikos patikimumu, buvo atliekami tyrimai su žinomos sudėties, pagamintais specialiu užsakymu užsienio laboratorijoje, glaudžiai bendradarbiaujančioje su DSS chromatografijos įrangos gamintoju, originaliais vitaminų spaudiniais. Vėliau buvo analizuojami tos pačios sudėties spaudiniai, paruošti “Endokrininių preparatų” gamykloje. Mažiausios paklaidos gautos dirbant su originaliais spaudiniais (B6 ir B1 iki 1,5%, B2 – 8%, o su gamykliniais gauta B1 – 5%, B2 – 11%, B6 – 3%). Didžiausios paklaidos nustatytos riboflavinui – nuo 8% iki 11%. Tad buvo analizuojama , kas įtakoja šio vitamino nustatymą. Įvertintas mėginių valymo būdas (centrifugavimas ir filtravimas). Buvo atliktos analizės mėginius tik centrifuguojant arba tik filtruojant. Filtruojant gauti B2 vitamino nuostoliai viršijo 8%, centrifuguojant – nesiekė 1%. Nustačius, kad B2 vitamino dalies netenkama filtravimo metu, analizei imta naudoti tik centrifugavimą. Kitų vitaminų (B1 ir B6) nustatymui valymo procedūra įtakos neturėjo (1 pav.)Eksperimento keliu parinkus B grupės vitaminų nustatymui optimalias analizės sąlygas (DSS chromatografija) tokios paklaidos: 2,01 0,05 riboflavinui, 5,07 0,05 tiaminui, 2,07 0,05 piridoksinui.Taigi buvo pritaikytas ir įsisavintas DSS chromatografijos metodas kompleksiniams B1, B2 ir B6 vitaminų nustatymui. Nustatyta, kad vitaminų mišinio valymo būdas turi įtakos B2 vitamino nuostoliams. Be to ne visos atvirkštinių fazių kolonėlės pasižymi pakankamu selektyvumu ir efektyvumu B grupės vitaminų analizei. Tinkamiausias yra Unisfer C18 ir LiChrospher C18, kuriomis gaunamas geriausias B1, B2, B6 vitaminų atskyrimas ir patikimiausi rezultatai. Paklaidos labiliausiems B2 vitaminui siekia iki 2,5%, o stabiliems B1 – nesiekia 1%.1 pav. Valymo būdo įtaka B grupės vitaminų kiekybiniam nustatymui
Literatūros sąrašas:
1. K.K. Unger (Hr sg.). Handbuch der HPLC. Teil 1. Git Verlag GMBH. Germany. 1989. 359psl.2. Angelica Grafzfeld – Hüsgen and Reiner Shuster. HPLC for Food Analysis. 1996. Germany. 132 psl.3. Journal of AOAC international. Vol. 75, No 3, 1992.
The advantages of HPLC (high chromatographic resolution, short analysis time, high sensivity to detect and determine analytes at very low concentrations) allowed to use this methode for the determination of the vitamins. The aim of the work was to apply the HPLC to the simultaneous quantitative analysis of thiamine, riboflavin and pyridoxine.
Key words: HPLC, thiamine, riboflavin, pyridoxine.