Fermentai

Fermentai
Įvadas
Vystantis chemijos ir fizikos mokslams, vis nauji metodai taikomi ir popieriaus konservavimo srityje. Viena naujausių mokslo šakų – biotechnologija atvėrė galimybę išskirti iš mikroorganizmų, augalinės ir gyvulinės kilmės medžiagų gamtinius biokatalizatorius – fermentus. Tai, kad iš organizmo išskirti fermentai išlaiko specifinę katalitinę funkciją, leido juos plačiai naudoti chemijos, maisto, farmacijos ir kitose pramonės šakose. Ši naujovė taikoma ir konservuojant popierių.
Kaip pagrindinė popieriaus klijavimo medžiaga šimtmečiais buvo naudojami krakmolo ir baltyminės kilmės klijai. Šiuolaikiniuose archyvuose ir bibliotekose, grafikos rinkiniuose gausu šiais klijais suklijuotų arr sumontuotų (originalo lapą paklijuojant tvirtesniu popieriaus ar kartono lapu) bei pataisytų (išplyšusiose vietose įklijuojant naują, atstatantį popieriaus lopinį) objektų.
Šiandien nemažai krakmolo ar baltyminės kilmės klijais klijuotų objektų yra labai pakenkti. Sendama klijinė medžiaga praranda elastingumą, todėl popieriuje gali atsirasti deformacijų, lūžių ir net išplėšimų. Be to, senėjimo procesas gali sukelti popieriaus spalvos pokyčius, atsirasti įvairaus intensyvumo dėmių. Pakenkimo vietose popierius pasidaro trapus.

XX amžiaus septintojo dešimtmečio pabaigoje popieriaus konservatoriai pastebėjo fermentų naudą šalinant senų baltyminių klijų ir kleisterių likučius. 1969 metais Paaulas Blanksas kaip priemonę, padedančią greitai pašalinti gyvulinių klijų apnašas, paminėjo kalogenazę, kalogeną ardantį fermentą. 1970 metais Otto Wendelbo aprašė vandens pažeisto rankraščio konservavimo procesą, kurio metu buvo naudojamas proteinus skaldantis fermentas tripsinas. Šio fermento dėka rankraščio lapai, sulipę į kietą bloką dė

ėl ištirpusių ir vėliau sukietėjusių klijų, buvo sėkmingai atskirti. 1977 metais Segalas, Cooperis ir Hattonas sukūrė naujus popieriaus konservavimo metodus, kuriuose buvo panaudota iš mikroorganizmo Streptomyces griseus išgauta proteazė ir iš mikroorganizmo Bacillus subtilis gauta a-amilazė. Eksperimentais buvo nustatyta, kad, esant optimalioms temperatūros ir pH reikšmėms, fermento kiekis gali būti minimalus. Autoriai pabrėžė fermento tirpalo rūgštingumo ir temperatūros svarbą.

Mokslininkai konservatoriai studijavo enzimologinę literatūrą, ieškodami naujų eksperimentinių metodų fermentų poveikio efektyvumui nustatyti bei jų panaudojimo saugumui įvertinti. Burgessas ir Carette’as ištyrė gyvulinės proteazės ir a-amilazės, gautos iš mikrogrybo Aspergillus oryzae, poveikį įvairių dailės kurinių popieriui bei dažams. Buvo paskelbta straipsnių, kuriuose aprašyti įvairūs fermentų panaudojimo konservuojant popierių aspektai.
Popieriaus konservavime galima išskirti tris sritis, kur dar reikia išsamesnių tyrimų. Pirma: fermentinių reakcijų produktų prrigimtis ir galimas jų žalingas poveikis objektui reakcijos metu. Antra: ar galima saugiai ir efektyviai pašalinti šiuos produktus iš objekto. Trečia: ar kokios nors fermentinių reakcijų liekanos gali padaryti žalos objektui, praėjus tam tikram laikui.
1. Fermentai

Fermentais vadinami specifiniai baltymai – biologiniai katalizatoriai, susidarantys bet kurioje gyvoje ląstelėje ir katalizuojantys įvairiausius cheminius procesus tiek ląstelėje, tiek ir išskirti iš jos.

Pagrindinės fermentų savybės yra didelis katalitinis aktyvumas, poveikio specifiškumas, termolabilumas ir grįžtamasis veikimas. Fermentų veikimas ir reakcijų greitis priklauso nuo temperatūros, terpės rūgštingumo (pH), pa
ašalinių medžiagų ir reakcijos produktų buvimo reakcijos terpėje, fermento kiekio ir aktyvumo, substrato koncentracijos.
Reakcijos metu fermentas daug kartų jungiasi su vis naujomis substrato molekulėmis, dėl to mažas fermentų kiekis katalizuoja didelio atitinkamų substratų kiekio pokyčius, pavyzdžiui, 1 dalis pepsino – 10 mln. dalių substrato (baltymo).
Būdinga fermentų savybė – ryškus poveikio specifiškumas, t.y. kiekvienas fermentas veikia tam tikrą substratą (išimtiniais atvejais – ribotą substratų skaičių) arba tam tikrą jungtį molekulėje. Substrato struktūra ir fermento aktyvusis centras turi tiksliai atitikti vienas kitą.

Vieni fermentai yra paprastieji, kiti – sudėtiniai baltymai. Pirmieji vadinami vienkomponenčiais, antrieji – dvikomponenčiais fermentais.

Vienkomponenčiai fermentai – tai globulinės struktūros baltymai. Tiek visų baltymų, tiek fermentų savybės priklauso nuo to, kokios aminorūgštys sudaro polipeptidinę grandinę, kaip ši grandinė susisukusi, t.y. nuo pirminės ir antrinės struktūros. Be abejo, ir tretinė fermento, kaip baltymo, struktūra turi labai didelę reikšmę jo katalitinėms savybėms. Net ir nežymiai pakitus jo baltyminės dalies struktūrai, labai pasikeičia fermento funkcinės savybės.

Gana daug fermentų sudaryta ne iš vienos polipeptidinės grandinės, o iš kelių ar keliolikos. Tokie subvienetai – protomerai – jungiasi į multimerus įvairiomis jungtimis. Fermento, skylančio į protomerus, aktyvumas labai sumažėja, pakinta specifiškumas. Vadinasi, katalitinei fermentų funkcijai didelę reikšmę turi ir ketvirtinė baltymo molekulės struktūra.

Vykstant katalitinei reakcijai substratas jungiasi su tam tikra fermento dalimi, kuri vadinama aktyviuoju fermento centru.

Įsivaizduokime, kad fermentas ir
r substratas sąveikauja per kelis aminorūgščių radikalus, kurie yra įvairiose fermento polipeptidinės grandinės vietose. Formuojantis tretinei baltymo struktūrai, šie radikalai suartėja. Denatūruojanti baltymui, fermentas praranda katalitinį aktyvumą. Taip yra todėl, kad denatūruojantis suyra jo trimatė erdvinė struktura, ir arti vieni kitų buvę aminorūgščių radikalai, per kuriuos sąveikaujama su substratu, nutolsta, pasiskirsto fermento molekulėje.

Biologiškai aktyvaus fermento konfigūracija turi būti tokia, kad substratas ant fermento galėtų būti fiksuojamas reakcijai vykti reikalingoje vietoje, t.y. „fermentas turi atitikti substratą, kaip raktas spyną“ (E. Fischerio 1896 m. paskelbta hipotezė).
Vadinasi, aktyvusis vienkomponenčio fermento centras yra sankaupa amiorūgščių radikalų, per kurių funkcines grupes sąveikaujama su substratu.

Dvikomponentis fermentas, dar vadinamas halofermentu, sudarytas iš baltyminės dalies – apofermento ir prostetinės grupės – kofermento. Kofermentas atsparesnis šilumai nei apofermentas, o halofermento atsparumas šilumai didesnis nei jo apofermento. Kofermentai yra nebaltyminiai junginiai, su apofermentais susijungę nevienodo stiprumo jungtimis. Kartais šios jungtys yra gana šilumos ir kofermentas nuo baltyminės dalies atskyla lengvai. Tada jį gali pririsijungti naujas baltymas ir susidaro naujas halofermentas.

Kofermentas sudaro labai mažą halofermento masės dalį (apie 1%). Kofermentai gali būti klasifikuojami taip: 1) nukleotidų tipo junginiai; 2) vitaminai ir 4 dariniai; 3) metalai ir metalų turintys junginiai; 4) kiti junginiai.

Kofermentų funkcijos yra: 1) dalyvauti katalizės procese; 2) užtikrinti kontaktą tarp fermento (baltymo) ir substrato; 3) stabilizuoti apofermentą. Tiesioginės katalitinės funkcijos vykdytojas yr
ra lyg ir kofermentas, tačiau jis negali veikti be baltyminės dalies – apofermento. Proceso specifiškumą sąlygoja baltymas, o substratą prijungia kofermentas. Tas pats kofermentas, prisijungęs prie skirtingų apofermentų, katalizuoja visiškai skirtingus procesus. Dvikomponenčių fermentų kofermentai atlieka aktyviojo centro funkciją, panašiai kaip ją atlieka vienkomponenčių fermentų atitinkamų aminorūgščių radikalų funkcinių grupių sankaupos.

Fermentai pagreitina labai lėtai vykstančius savaiminius cheminius procesus, t.y. sumažina reakcijos aktyvacijos energiją. Svarbiausia yra tai, kad fermentas jungiasi su substratu ir susidaro nepatvarus fermento ir substrato kompleksas. Šis procesas susideda – iš kelių etapų: pirmame fermentas (F) jungiasi su substratu (S) ir susidaro jų kompleksas (FS), antrame substratas aktyvinamas (FS’), trečiame vyksta substrato pokyčiai (FP) ir ketvirtame reakcijos produktai atsiskiria nuo fermento:
F + S ↔ FS – FS’ – FP ↔ F + P

Susidarant fermento ir substrato kompleksui, keičiasi substrato molekulės struktūra, atsiranda jo pereinamosios formos. Fermentas su substratu jungiasi joninėmis, vandenilinė mis jungtimis. Gali susidaryti laikinos kovalentinės jungtys (kintant substratui). Fermento – substrato kompleksai yra itin labilūs: egzistuoja tik sekundės dalis. Vykstant fermento ir substrato sąveikai, substrate indukuojami ardomų jungčių įtempimai, vyksta jų deformacija ir destabilizacija. Šios jungtys tampa mažiau stabilios, negu buvo laisvame substrate, dėl to fermentinė reakcija vyksta greitai.

Fermentams būdingas specifinis katalitinis veikimas. Fermento – substrato kompleksas gali susidaryti dėl tam tikro fermento ir substrato giminingumo (jau minėta E. Fischerio hipotezė, kad fermentas turi atitikti substratą, kaip raktas spyną). Fermentinių reakcijų greitis visų pirma priklauso nuo fermento aktyvumo, tačiau jam turi įtakos ir kiti veiksniai.

Cheminės reakcijos greitis priklauso nuo temperatūros. Temperatūrai pakilus 10°C, cheminės reakcijos greitis padidėja maždaug dvigubai. Vykstant fermentinėms reakcijoms, šis dėsnis galioja tik iki tam tikros ribos. 0°C ir žemesnėje temperatūroje fermentiniai procesai beveik nevyksta. Kylant temperatūrai fermentiniai procesai suaktyvėja. Temperatūrai pakilus iki tam tikro lygio, prasideda fermento, kaip baltymo, denatūracija – fermentai deaktyvuojasi. Šiluminis daugumos baltymų denatūravimasis yra negrįžtamas procesas. Tačiau esama fermentų, kurių aktyvumas po kurio laiko iš dalies atsinaujina. Pavyzdžiui, tripsinas – kasos sulčių fermentas – šildomas deaktyvuojasi, bet po tam tikro laiko jo aktyvumas vėl atsistato.

Baltymų denatūracijos temperatūra priklauso nuo jų struktūros ypatybių. Kiekvienai fermentinei reakcijai būdinga optimali temperatūra. Daugumos gyvulinių fermentų optimali veikimo temperatūra yra 40-50°C, augalinių – 50-60°C. Aukštesnėje kaip 70°C temperatūroje daugumas fermentų netenka aktyvumo. Tačiau yra ir išimčių. Dideliu termostabilumu pasižymi termofilinių mikroorganizmų fermentai: kai kurių jų aktyvumas nepakinta net trumpai pavirinus.
Žemesnėje ir neigiamoje temperatūroje daugumos fermentų aktyvumas išlieka. Grąžinti į palankias sąlygas, fermentai vėl tampa aktyvūs.

Fermentai yra jautrūs terpės pH pokyčiams. Kiekvienas fermentas gali būti maksimaliai aktyvus tik esant tam tikrai terpės vandenilio jonų koncentracijai. Daugeliui fermentų optimalios pH reikšmės yra 5,0-8,0. Dauguma fermentų esti aktyviausi, kai terpės pH atitinka fermento izoelektrinį tašką. Nukrypus pH į vieną ar kitą pusę nuo optimalios reikšmės, fermento aktyvumas sumažėja [1,3].

Dažniausiai priklausomai nuo terpės pH gali jonizuotis ir atitinkamos substrato grupės.
Esant tam tikroms pH reikšmėms, gali pakisti fermento struktūra, susilpnėti jungtys tarp apofermento ir kofermento. pH turi įtakos fermento ir substrato sąveikai, kartu ir visam katalizės procesui.

2. Fermentų panaudojimas popieriaus konservavimui

Kalbant apie fermentų panaudojimą konservuojant popierių, optimalių temperatūros ir pH reikšmių svarba fermentinių reakcijų veiksmingumui neturėtų būti pervertinta. Daugeliu atvejų patys sudrėkinti klijų likučiai ar dejonizuotas vanduo, kuriame gaminami fermentų tirpalai, sukuria patenkinamą aplinką fermentui veikti. Temperatūrą galima kiek padidinti siekiant kompensuoti pH nukrypimus nuo optimalios reikšmės. Ir pagaliau, nors reakcijos greitis neabejotinai padidėja palaikant kurio nors vieno ar abiejų faktorių optimalias reikšmes, patenkinamus rezultatus galima gauti net ir griežtai nesilaikant šių reikalavimų.

Fermentų katalitiniam aktyvumui turi įtakos ir tirpale esančios medžiagos. Vienos jų aktyvuoja fermentų veikimą – tai aktyvatoriai, kitos silpnina arba visai sustabdo jų veikimą – inhibitoriai.
Fermentų veikimą kartais slopina fermentinės reakcijos produktai, sudarydami su fermentu kompleksinius junginius (lengviau nei pradinė medžiaga).

Didėjant substrato koncentracijai, reakcijos greitis didėja iki maksimalaus, tai reiškia, kad fermento molekulių aktyvieji centrai jau prisotinti substrato, vėliau reakcijos greitis nebepriklauso nuo substrato koncentracijos.

Jeigu fermentinė reakcija vyksta esant substrato pertekliui, jos greitis tiesiog proporcingas fermento kiekiui (jei reakcijos aplinkoje nėra inhibituojančių medžiagų).

Konservuojant popierių labai svarbūs yra hidrolazių klasei priskiriami, hidrolizės reakcijas katalizuojantys fermentai. Tai visų pirma amilazės, krakmolą skaldantys fermentai, kurie pagreitina senų krakmolo kleisterių ardymą, ir antra, proteazės, baltymą skaldantys fermentai, kurie paspartina senų baltyminių klijų ardymą.

Krakmolas sudarytas iš amilozės (apie 25%) ir amilopektino (apie 75%). Amilozėje α-gliukozės molekulės sujungtos α-(l,4)-glikozidine jungtimi, jos struktūra linijinė, molekulinė masė apie 60 000. Gerai tirpsta šiltame vandenyje.

Amilopektino struktūra šakota. Atsišakojimų vietose gliukozės molekulės jungiasi α-(l,6)-glikozidinėmis jungtimis. Atšakose būna 8-20 gliukozės likučių. Amilopektino molekulinė masė gerokai didesnė – siekia 1 000 000 ir daugiau. Sunkiai tirpsta vandenyje, sudaro koloidinius tirpalus.

Krakmolą hidrolizuoja fermentai: α- ir β-amilazės, amilo-(l,6)-gliukozidazė ir gliukoamilazė.
α-amilazė katalizuoja polisacharidų vidinių (1-4)-glikozidinių jungčių hidrolizę (ji yra endoamilazė). Krakmolo skilimo produktai yra dekstrinai ir nedidelis kiekis maltozės. α-amilazės aktyvumui būtinas kofaktorius Ca2+. Kalcio jonai stabilizuoja antrinę ir tretinę α-amilazės molekulės struktūrą. Ca2+ jonai padidina fermento stabilumą, kintant terpės pH ir temperatūrai. Pašalinus Ca2+ jonus α-amilazė deaktyvuojasi.

β-amilazė, dar vadinama maltogenine, veikia tas pačias jungtis, kaip ir α-amilazė, tik esančias polisacharido grandinės galuose, ir atskelia disacharidą maltozę (ji yra egzoamilazė). Taigi ji katalizuoja kas antros (l-4)-glikozidinės jungties hidrolizę nuo to grandinės galo, kuriame nėra laisvų redukuojančių grupių.

α-(l,6)-glikozidinės jungtys amilopektine skaidomos katalizuojant amilo-(l,6)-gliukozidazei (pululanazei).

Gliukoamilazė (egzo-(l,4)-α-D-gliukozidazė) skaldo krakmolą, palaipsniui atskeldama nuo neredukuoto grandinės galo gliukozės molekules. Taip polisacharidas suskaldomas iki gliukozės.Gliukoamilazė paprastai gaunama iš pelėsinių grybų Aspergillus niger, Aspergilius usamii, Rhizopus niveus.

Baltymų ir peptidų hidrolizės procesus katalizuoja hidrolazių klasės fermentai – peptidų hidrolazės. Fermentai, skaldantys baltymus, atrasti XVIII amžiuje. Tada dar nebuvo žinoma peptidinės jungties prigimtis ir šie fermentai buvo pavadinti proteolitiniais. Šis pavadinimas išlikęs iki šių dienų.

Pagrindinė reakcija, katalizuojama proteolitinių fermentų, tai peptidinės jungties hidrolizė:

R R’ R R’

| | | |
–NH–CH–C–NH–CH–C– + H2O � –NH–CH–COOH + NH2–CH–C–

|| || ||

O O O

Įvairios peptidų hidrolazės katalizuoja ne visų peptidinių jungčių hidrolizę, t.y. jos veikia pagal tai, kokias aminorūgštis jungia šios peptidinės jungtys. Taip yra todėl, kad vykstant reakcijai tarp fermento (kurios nors peptihidrolazės) ir substrato (baltymo) kompleksas susidaro tik per tam tikros, peptidine jungtimi sujungtos, aminorūgšties radikalą. Taigi konkreti peptihidrolazė gali katalizuoti tik tam tikros peptidinės jungties hidrolizę.

Peptihidrolazių poklasis skirstomas į šias grupes: 1) aminopeptidazės, 2) karboksipeptidazės, 3) dipeptihidrolazės, 4) proteinazės.

Pirmų trijų grupių fermentai atskelia galines baltymų aminorūgštis. Ketvirtai grupei priklausantys fermentai hidrolizuoja tiek galines, tiek ir molekulių vidines peptidines jungtis. Šios grupės atstovai: pepsinas, tripsinas, chimotripsinas – gyvulinės kilmės, o papainas, ficinas, bromelinas – augalinės kilmės fermentai. Iš mikroorganizmų gautos proteazės pasižymi platesniu specifiniu poveikiu substratui. Be to, daugeliu atvejų jos žymiai aktyvesnės nei gautos iš augalų ar gyvūnų audinių.

Proteolitiniai iš mikroorganizmų gauti fermentai dažniausiai yra sudėtingi peptidazių ir proteinazių kompleksai, kurie suskaldo baltyminį substratą iki aminorūgščių mišinio.
Labai didelė grupė proteolitinių fermentų – tai fermentai, turintys savo aktyviajame centre metalo jonus (Mg2+, Mn2+, Co2+, Zn2+). Būdami aktyviuose šių fermentų centruose, metalų jonai gali dalyvauti katalizės procese, gali būti fermentą ir substratą jungiančia grandimi.

Naudojant fermentus popieriui konservuoti, labai svarbu iš anksto žinoti apie jų galimą pašalinį poveikį objektui. Tai lemia keletas faktorių, priklausančių nuo (1) fermento grynumo, (2) galimybės pašalinti fermentą iš popieriaus ir (3) galimybės deaktyvuoti popieriuje likusį fermentą.

Be to, svarbu žinoti fermentų pavadinimus, juos charakterizuojančius vienetus ir jų aktyvumus. Aktyvumo vienetai pateikiami kataloguose specifinius fermentų tipus išvardijančiuose sąrašuose, kartais ir ant pakuočių. Šie vienetai nustatomi vykdant reakciją su specifiniu standartiniu substratu, standartinėmis sąlygomis (pH, temperatūra) ir matuojant, kiek fermento vienetų optimaliai suskaldo substratą.

Aktyvumas – tai fermento aktyvumo vienetų skaičius tam tikrame fermento baltyminės masės kiekyje (miligramais). Pavyzdžiui, dviejų skirtingų α-amilazių aktyvumas nevienodas: tipo II-A (A6380) iš Bacillus sp. aktyvumas 1500-3000 vienetų/mg, tai reiškia, kad ji – labai grynas fermentas; tipo XI-B (A 3051) taip pat iš Bacillus sp. aktyvumas 500-1000/mg, taigi jis ne toks grynas. Žinoma, už grynumą tenka ir sumokėti.

Medžiagos grynumas priklauso nuo dviejų faktorių:
1) nuo baltymo, t.y. fermento, procentinio kiekio medžiagoje;
2) nuo proteinų frakcijos homogeniškumo (nuo to, ar turime vienos rūšies fermentą, ar jų mišinį).

Fermento grynumo reikalavimai, kuriuos kelia jo pramoniniai vartotojai, dažnai yra kur kas švelnesni nei reikalavimai, keliami popieriaus konservatorių. Daugeliui chemijos kompanijų klientų grynas fermentas nereikalingas. Į pramonėje naudojamus fermentus pridedama druskų, rūgšties, apsauginių priemolių bei užpildo, pavyzdžiui, pjuvenų. Fermentai, skirti virškinimui skatinti ar kontaktiniams lęšiams valyti, taip pat nėra švarūs ir popieriui konservuoti netinka. Konservatoriai taip pat turi vengti preparatų, skirtų fermentų moksliniams tyrimams, nes juose esama stabilizatorių. Todėl būtina atidžiai išstudijuoti produkto aprašymą, net jei fermentas gautas iš firmos, kuri specializuojasi reagentų gamyboje. Galima pasirinkti fermentus, apibūdintus „be pašalinių priemaišų“. Reikėtų vengti preparatų su prierašu „neapdirbtas“, kaip ir preparatų, jau atskiestų buferiniu tirpalu. Kelių fermentų mišiniai, parduodami kaip vienas reagentas, kartais gali praversti. Tokiu atveju reikia įsitikmti, kad visi mišinio komponentai išvardyti aprašyme.

Naudojant fermentus popieriui konservuoti, labai svarbu atkreipti dėmesį į tai, ar juose nėra celulazių ir lipazių priemaišų. Lipazės (riebalus, aliejus skaldantys fermentai) gali sukelti papildomų problemų, kai jos naudojamos mišrios sudėties objektų restauravimui, pvz., kai spaudos dažų rišamoji medžiaga būna aliejinės bazės.

Nerimą keltų ir fermente esančios celulazės (celiuliozę ardančio fermento) priemaišos, nes mikroorganizmai, gaminantys proteazę ir a-amilazę, taip pat gamina ir celulazę. Tačiau valymo technika dabar yra taip išvystyta, kad celulazių praktiškai nebūna. Iš tiesų šiuolaikiniai metodai, kuriais reguliuojama fermentus išskiriančių mikroorganizmų DNR, įgalina išskirti tik pageidaujamą fermentą. Be to, pasitikėjimą teikia celiuliozės atsparumas celulazės atakoms. Komercinė celulazė gerai veikia išvestines celiuliozės medžiagas, pavyzdžiui, karboksimetilceliuliozę, bet grynos celiuliozės visai neveikia arba veikia labai lėtai. Medvilnės plaušų popierius yra gana atsparus celulazės poveikiui. Popieriaus masė, turinti lignino, yra dar atsparesnė, nes ligninas blokuoja fermento poveikį celiuliozei. Nustatyta, kad celiuliozė yra gana atspari ardančiam fermento poveikiui netgi po hidrolizės atskiestomis rūgštimis, todėl atsitiktinės celulazės priemaišos taip lengvai nepaveiks net rūgščių pažeisto popieriaus.

Prieš perkant fermento preparatą, konservatoriui reikia įvertinti jo charakteristikas. Fermentai, gauti iš termofilinių bakterijų, nepageidautini, nes yra labai stabilūs temperatūros atžvilgiu. Manoma, kad mažos molekulinės masės fermentai lengviau išplaunami iš popieriaus, todėl tikslingiau pirkti fermentus, kurių molekulinė masė palyginti nedidelė (apie 20 000-30 000 atominių vienetų), nei tuos, kurių molekulinė masė didelė (per 50 000 atominių vienetų). Svarbu atsižvelgti ir į fermento aprašyme nurodytą hidrolizės reakcijos greitį, t.y. jo aktyvumą. Jei keliamus reikalavimus atitinka keli preparatai, verta pasirinkti fermentą su didžiausiu aktyvumo vienetų skaičiumi duotam reagento svoriui.

Panaudojus aktyvesnį reagentą tikslesniu procentu bus lengviau plaunant pašalinti fermento preparatą iš objekto.

Pastaruoju metu restauratoriai dažnai naudoja įvairių fermentų mišinius, vadina juos „fermentų kokteiliais“. Šiuose mišiniuose fermentų koncentracija būna didelė, nes tik tada „kokteilis“ apskritai veikia. Nors tiesiogiai veikia tik maža visų tokiame tirpale aktyvuotų fermentų dalis, pašalinti visą nemažą baltymų kiekį darosi nelengva.

Konservuojant popierių svarbu ne tik teisingai pasirinkti preparatą, bet ir tinkamai išplauti fermentų likučius. Konservavimo literatūroje aprašytose plovimo procedūrų metodikose pateikiamos rekomendacijos, kaip deaktyvuoti popieriuje likusį fermentą. Kaip vieną iš fermentų likučių deaktyvavimo metodų autoriai rekomenduoja apdoroti fermentais paveiktas sritis alkoholio pertekliumi. Cooperio, Kingo ir Segalo tyrimuose buvo pateikta tokia reakcija:
fermentas (aktyvus) + tirpiklis →junginys (neaktyvus).

Fermentų „elgesys“ organiniuose tirpikliuose nebūtinai susijęs su fermento tirpiklio junginio susidarymu. Fermento ir tirpiklio sąveika aiškinama skirtingais fermento-tirpiklio ir fermento-vandens jonizacijos lygiais. Etanolis turi mažesnę dielektrinę konstantą negu vanduo. Kadangi, esant mažesnei dielektinei konstantai, padidėja traukos jėgos tarp dviejų priešingų krūvių, etanolis sumažina proteinų jonizaciją, tokiu būdu stimuliuodamas baltymų koaguliaciją. Taigi fermentą galime laikyti „atviru“ ir linkusiu reaguoti su substratu vandens tirpale, bet „uždaru“ ir neimliu substratui organiniame tirpiklyje. Koaguliavęs fermentas yra sunkiai pašalinamas iš popieriaus. Vadinasi, jei manoma, kad fermento deaktyvacija yra būtina, ji turi būti atlikta po plovimo procedūros. Deaktyvuoti fermentą galima ir denatūruojant, t.y. suardant erdvinę fermento molekulių struktūrą. Denatūracijos būdu deaktyvuotas fermentas esant palankioms sąlygoms gali regeneruotis, tačiau tai mažai tikėtina, jei darbui naudojamas minimalus fermento kiekis, o fermentu paveiktas plotas prieš denatūravimą kruopščiai išplaunamas.

Kaip priemonė denatūruoti fermentą, išlikusį popieriuje po plovimo, naudojamas objekto apdorojimas vandens vonioje palaikant 50-70°C temperatūrą. Tačiau toks denatūravimo metodas netinka α-amilazėms (gautoms iš Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Aspergillus oryzae ir Aspergillus niger). Tai metalofermentai, turintys savo struktūroje kalcio ir galintys atlaikyti iki 100°C temperatūrą. Denatūruojant α-amilazes 100°C arba žemesnėje temperatūroje, būtina pašalinti apsauginį kalcį, naudojant chelatinimo agentą (pavyzdžiui, EDTA)

Iš S. griseus išgauta proteazė taip pat atspari aukštai temperatūrai. Nors kalcis ir neįeina į tokios proteazės natūralią struktūrą, fermentas linkęs prisijungti kalcio, magnio ir kai kuriuos kitus dvivalenčius katijonus iš tirpalo, taip apsisaugodamas nuo šiluminės deaktyvacijos. Popieriaus konservatoriai turi žinoti apie šią S. griseus proteazės savybę, nes daugelis jų kokia nors forma naudoja kalcį ir magnį, pašarmindami šio fermento tirpalą iki jo optimalios (7,5) pH reikšmės. Tokiu būdu fermentas netyčia stabilizuojamas temperatūros atžvilgiu. Reikia pažymėti, kad galutinis nurūgštinimo etapas taip pat stabilizuoja bet kokius fermento likučius.

Kai kurie mokslininkai pateikia svarių argumentų, siulydami fermentų poveikio metu praleisti deaktyvacijos etapą, jeigu buvo panaudota mažiausia galima fermento koncentracrįa, o objektą galima intensyviai išplauti. Šio požiūrio besilaikantys mokslininkai pabrėžia, kad svarbu išlaikyti fermentą stabilų pradinėje plovimo stadijoje ir fermentui dar esant popieriuje išvengti koaguliacijos. Tyrimais įrodyta, kad restauruojamą objektą ilgai plaunant vandenyje arba trumpai jį praplaunant buferiniame tirpale ir tik po to ilgai plaunant vandenyje, išplaunamas visas panaudotas fermento kiekis. Kuo didesnė fermento tirpalo koncentracija, tuo ilgiau reikia plauti. Popierių visiškai pakanka plauti vieną valandą, pakeičiant vonelėje vandenį mažiausiai 2 kartus. Gerai išplauti fermentus iš popieriaus būtina dėl dviejų priežasčių: 1) fermentų (baltymų) likučiai gali sukelti popieriaus pageltimą, popierius darosi trapus; 2) fermentų likučiai popieriuje gali reaktyvuotis, sukeldami kleisterinių ar baltyminės kilmės įklijinamųjų medžiagų irimą. Be to, fermentais paveiktų, tačiau dar neplautų lakštų negalima veikti kitais tirpalais.

2.1 Fermentų tyrimas

Šis tyrimas buvo atliktas Biotechnologijos institute, norint paskatinti Lietuvos popieriaus restauratorius savo darbe naudoti fermentus.
2.1.1 Darbo tikslas

Lietuvoje konservatoriai iki šiol dar gana atsargiai naudoja fermentus popierui konservuoti, šalinti senus klijus, jų dėmes bei apnašas. Taip pat susiduriama su nemažais sunkumais renkantis ir įsigyjant darbui reikalingus fermentus.

Šio darbo tikslas – pritaikyti popieriui konservuoti maisto pramonėje naudojamus ir gana lengvai įsigyjamus fermentus:
1) įvertinti pasirinktų fermentų veikimo efektyvumą hidrolizuojant pasendintus krakmolo ir baltyminės kilmės klijus, nustatyti optimalias fermentų koncentracijas ir veikimo sąlygas;
2) ištirti šių fermentų poveikį popieriui, įvertinti jų panaudojimo saugumą popieriaus (restauruojamo objekto) atžvilgiu.
2.1.2 Darbo eiga

Tyrimams pasirinkti Lietuvos maisto pramonėje naudojami fermentai („Novo Nordisk Ferment Ltd.“ prekių katalogas):
BAN – bakterinė amilazė Novo-α-amilazė, išskirta iš Bacillus amyloliquenfaciens. Sisteminis pavadinimas (l,4)-α-D-gliukan-gliukano-hidrolazė (EC 3.2.1.1.). Stabilizuota Ca2+ jonais. BAN yra endoamilazė. Fermentas hidrolizuoja amilozės ir amilopektinų (1,4)-α-glukozidines jungtis tiek krakmolo tirpale, tiek ir gelyje. Skaldymo produktai – dekstrinai ir oligosacharidai.
Optimalaus veikimo sąlygos: T – 70°C; pH – 6; tris-maleato buferinis tirpalas.
Promozyme – karščiui atsparus fermentas, išskirtas iš bakterijos Bacillus acidopullulyticus kamieno. Jis priklauso fermentų grupei, žinomai pululanazių pavadinimu (BC 3.2.1.41, pululan-6-gliukano-hidrolazė). Promozyme katalizuoja (1,6)-α-jungties hidrolizę amilopektine. Promozyme gerai tinka skaldyti tirpale esantį krakmolą.
Optimalaus veikimo sąlygos: T – 60°C; pH – 5; citratinis buferinis tirpalas.
Fermentas deaktyvuojamas šildant apie 5 min. 85°C arba apie 40 min. 80°C temperatūroje.
AMG – Amilogliukozidazė Novo yra egzo-(l,4)-α-D-gliukozidazė (gliukoamilazė), išskirta iš vieno mikrogrybo Aspergillus kamieno. Sisteminis jos pavadinimas (l,4)-α-D-gliukan-gliukohidrolazė (EC 3.2.1.3). Šis fermentas skaldo krakmolą (1,4)-α- ir (1,6)-α- jungties vietoje.
Optimalaus veikimo sąlygos: T – 55°C; pH – 4,5; acetatinis buferinis tirpalas.
Fermentas deaktyvuojamas šildant apie 5 min. 80°C arba apie 40 min. 75°C temperatūroje.
Alkalazė – tai serino tipo proteazė, pagaminta iš bakterijos Bacillus licheniformis kamieno. Alkalazė hidrolizuoja baltymus iki peptidų, kurie gerai tirpsta vandenyje ir gali būti lengvai išplaunami.
Optimalaus veikimo sąlygos: T – 60°C; pH – 8-9; boratinis buferinis tirpalas.
Neutrazė – tai neutrali proteazė, pagaminta iš bakterijos Bacillus amyloliquenfaciens kamieno. Neutrazės sudėtyje yra neutralios B. amyloliquenfaciens proteazės ir nestandartizuotas b-gliukanazės kiekis. Šis fermentas, kaip ir kitos proteazės, skaldo baltymus iki peptidų.
Optimalaus veikimo sąlygos: T – 45°C; pH – 6; fosfatinis buferinis tirpalas.
Fermentas deaktyvuojamas virimo temperatūroje.

Eksperimento metu naudoti fermentų tirpalai buferiniuose tirpaluose. Fermentai BAN, Promozyme ir AMG tirpinti acetatiniame buferiniame tirpale, pH – 5. Naudoti šių fermentų mišinių tirpalai acetatiniame buferiniame tirpale. Alkalazė tirpinta boratiniame, pH – 8; neutrazė – fosfatiniame buferiniame tirpale, pH – 6.
Acetatinis buferinis tirpalas (pH – 5): 73,4 ml 1N CH3COH; 50 ml 1N NaOH;
376,6 ml dejonizuoto H2O.
Fosfatinis buferinis tirpalas (pH – 6): 12,1 ml 1/15 M Na2HPO4 12H2O; 87,9 ml l/15 M KH2PO4.
Boratinis buferinis tirpalas (pH – 8): 55,85 ml 0,05 M Na2B4O7 10H2O; 44,15 ml 0,1N HCl.

Tyrimams naudotas pramoninės gamybos akvarelinis medienos celiuliozės popierius „Allegretto“ (Vokietija), 150 g/m2, pH – 8,7.
3.1.2. Fermentų poveikio pasendintiems klijams įvertinimas, optimalių fermentų veikimo sąlygų nustatymas

Siekiant įvertinti fermentų poveikio klijams efektyvumą, kaip substratas buvo naudoti: baltymų standartas – 5% želatinos klijai, krakmolo standartas – 10% kviečių krakmolo („Amiel“, Austrija) klijai.

Iš dviejų popieriaus lapelių (4×4 cm) suklijuotos dvi grupės pavyzdžių: viena grupė suklijuota 10% kviečių krakmolo klijais, kita grupė – 5% želatinos klijais. Suklijuoti pavyzdžiai sendinti „sausoje“ krosnyje 103 ± 2°C temperatūroje 72 valandas, tai atitinka 25-28 natūralaus senėjimo metus.

Fermentinė pasendintų klijų hidrolizė buvo vykdoma džiovinimo krosnyje, palaikant pastovią 40°C aplinkos temperatūrą. Kiekvienas suklijuotas pavyzdys buvo merkiamas į jau pašildytą iki 40°C fermento tirpalo vonelę. Pavyzdžiai iš fermento tirpalo vonelės buvo išimami po 20, 40, 60 min., nusausinami filtriniu popieriumi. Dar drėgni suklijuoti pavyzdžio lapeliai atskiriami vienas nuo kito.

Fermentų poveikis klijams buvo įvertintas pagal suklijuotų pavyzdžio lapelių atskyrimo lengvumą. Atlikta serija bandymų, keičiant fermentų tirpalų koncentraciją ir jų veikimo laiką.
Kiekvieno pavyzdžio suklijuotų lapelių atskyrimo lengvumas buvo sąlygiškai įvertintas balais:
0 – lapeliai neatsiskiria;
1 – lapeliai atsiskiria sunkiai, su dideliais popieriaus paviršiaus pažeidimais;
2 – lapeliai atsiskiria, popieriaus paviršiaus pažeidimai nedideli;
3 – lapeliai atsiskiria lengvai, be popieriaus paviršiaus pažeidimų;
4 – lapeliai atsiskiria labai lengvai; be pažeidimų;
5 – klijai visiškai praradę savo savybes.

Eksperimentu siekta ištirti pasirinktų fermentų poveikį pačiam popieriui. Tyrimams naudoti pramoninės gamybos balintos cheminės celiuliozės popieriaus pavyzdžiai (be klijų).
Buvo išskirtos keturios pavyzdžių grupės:
1) nepaveikta grupė;
2) 60 min. mirkyta dejonizuotame vandenyje, 40°C, pH – 5,3;
3) 60 min. mirkyta 1% fermento tirpale (40°C), neperplauta dejonizuotu vandeniu;
4) 60 min. mirkyta 1 % fermento tirpale (40°C), po to plauta 3 kartus po 20 min. dejonizuotame vandenyje.

Siekiant išryškinti bet kurį nepageidautiną efektą, kurį panaudotas fermentas gali sukelti popieriui, trečios grupės pavyzdžiuose fermentas nebuvo išplautas.
Antra grupė skirta dejonizuoto vandens poveikiui nustatyti, nes eksperimento metu dejonizuotas vanduo buvo naudotas tiek tirpalams gaminti, tiek ir pavyzdžiams praplauti. Be to, buvo palaikoma 40°C vandens temperatūra, kad gauti rezultatai būtų lygintini su fermento tirpale laikytų pavyzdžių.

Eksperimentas buvo atliekamas džiovinimo krosnyje, palaikant pastovią 40°C aplinkos temperatūrą. Pavyzdžiai merkiami į jau pašildytą iki 40°C tirpalo vonelę.

Apdorojus popieriaus pavyzdžius tirpalais, kiekviena bandinių grupė buvo padalyta į dvi dalis. Viena pavyzdžių dalis palikta nesendinta, kita – sendinta „sausoje“ krosnyje 103 ± 2°C temperatūroje 72 valandas.

Popieriaus optinės charakteristikos matuotos kalorimetru „Spektroton“, apimančiu regimosios šviesos bangų spektrą (380-700 nm) ir turinčiu šviesos šaltinį C (x = 0,310; y = 0,316). Šviesos atspindžio režime prietaisas užrašo spalvų koordinates X, Y, Z CIE 1931 m. sistemoje, taip pat koordinates L, a, b CIELab sistemoje; taip pat pateikia (x, y) spalvines koordinates, pageltimo ir šviesio reikšmes bei visų pokyčių išvestinį dydį – spalvos skirtumą ΔE.
Spalvos skirtumą ΔE galima apskaičiuoti naudojantis formule:
ΔE=[(ΔL)2+(Δa)2+(Δb)2] 1/2,
kur ΔL = Lmatuojamo — L kontrolinio,
Δa = a matuojamo — a kontrolinio,
Δb = b matuojamo – b kontrolinio.
ΔE matuojamas palyginimo principu kontrolinio pavyzdžio atžvilgiu. Siekiant išryškinti fermentų poveikį popieriui, kaip kontrolinis pavyzdys naudotas dejonizuotu vandeniu apdorotas popierius, taip eliminuojant dejonizuoto vandens įtaką.
Šviesis apskaičiuojamas pagal formulę:
W=100- ΔE,
kur ΔE gaunamas, atliekant matavimus idealiai balto paviršiaus atžvilgiu.
Popieriaus pH matavimai atlikti universaliu jonometru 3B-74 šalto ekstrahavimo metodu laikantis standarto GOST 12523-77.

2.1.3Tyrimo rezultatai

Remiantis tyrimo rezultatais galima konstatuoti, kad pasirinkti fermentai hidrolizuoja pasendintus krakmolo bei baltyminės kilmės klijus. Klijų hidrolizės efektyvumas priklauso nuo fermentų koncentracijos ir veikimo laiko (1 lent).

Hidrolizuojant krakmolo klijus a-amilaze naudojant 2% fermento tirpalą, klijų suskaldymas, leidžiantis atskirti du suklijuotus pavyzdžio lapelius, pasiekiamas po 60 min. Toliau didinant a-amilazės tirpalo koncentraciją, fermento poveikis klijams nebedidėja

Naudodami pasendintų krakmolo klijų hidrolizei fermentų mišinį α-amilazė+ promozyme (1:1), matome, kad šis fermentų mišinys veikia efektyviau nei viena α-amilazė. Didinant mišinio koncentraciją, fermentų poveikis klijams stiprėja. Geriausiai atsiskiria 3% α-amilazės + promozyme (1:1) mišinio tirpaluose apdoroti pavyzdžiai. Tačiau didėjant mišinio koncentracijai, fermentų poveikio efektyvumas auga nežymiai (rezultatai sulyginami). Todėl konservuojant popierių krakmolo klijams šalinti užtektų naudoti 1% α-amilazės + promozyme (1:1) mišinio tirpalą (poveikio laikas – 60 min.).

Fermentų mišinys α-amilazė + promozyme + gliukoamilazė (1:1:1) veikia efektviau nei α-amilazė + promozyme (1:1). 1% fermentų α-amilazės + promozyme + liukoamilazės mišinio tirpale 60 min. apdoroti pavyzdžiai atsiskiria labai lengai, be popieriaus paviršiaus pažeidimų. Vis dėlto konservuojant popierių seniems krakmolo klijams šalinti užtektų naudoti 0,5% α-amilazės + promozyme + gliukoamilazės mišinio tirpalą (poveikio laikas – 60 min.).
Pasendintų baltyminės kilmės klijų hidrolizei buvo naudoti fermentai alkalizė ir neutrazė (2 lent.). Galima pastebėti, kad šie fermentai veikia labai efektyviai. Konservuojant popierių baltyminės kilmės klijams šalinti užtektų naudoti ,1% šių fermentų tirpalus (poveikio laikas – 60 min.). Tačiau, žinoma, konkrečiu tveju pasirinkimas priklauso nuo restauruojamo objekto, jo būklės bei pažeidimo laipsnio.

Šiame tyrime, sprendžiant apie fermentų poveikį pasendintiems klijams, buvo remtasi praktiniais stebėjimais: įvertinta, kaip lengvai po apdorojimo fermentų tirpalais atsiskiria du suklijuoti pavyzdžio lapeliai. Tai gana subjektyvus ir apytikslis metodas. Tokio empirinio tyrimo būdu gauti duomenys leido nustatyti tik bendras fermentų poveikio klijams tendendjas bei apytiksliai įvertinti fermentų koncentracijos ir veikimo laiko įtaką senų klijų hidrolizei. Analizuojant fermentinės hidrolizės metu susidariusius reakcijos produktus, būtų galima tiksliai įvertinti fermentinės reakcijos efektyvumą. Tačiau tam reikalinga sudėtinga įranga. Vis dėlto minėtus tyrimus būtina atlikti.

Paveikus popierių fermentais ir jų po to neišplovus, popieriaus šviesis praktiškai nepakito (lyginama su neapdoroto fermentais popieriaus šviesiu). Tačiau pasendinti tokie popieriaus pavyzdžiai patamsėjo (išskyrus popierių, paveiktą alkalaze). Vadinasi, fermentų (baltymų) likučiai keičia sendinamo popieriaus optines savybes ir popierius tamsėja.

Popieriaus šviesio testas neparodė ryškesnių skirtumų tarp kontrolinės grupės (be fermento) bei pavyzdžių, apdorotų fermentų tirpalais ir po to praplautų dejonizuotu vandeniu. Pavyzdžių, po apdorojimo fermentais praplautų vandeniu ir po to pasendintų, popieriaus šviesis praktiškai nepasikeitė. Galima padaryti išvadą, kad panaudoti fermentai gerai išsiplauna iš popieriaus ir neturi įtakos sendinamo popieriaus šviesiui.

Reikia pažymėti, kad optinio prietaiso parodymuose iki 1 % šviesio reikšmių skirtumas gali būti laikomas matavimo paklaida. Kadangi prietaisas matuoja atspindėtą šviesą, paklaida gali atsirasti ir dėl popieriaus paviršiaus reljefo pokyčių.

Apdorojus pavyzdžius fermentų tirpalais pastebimas nedidelis popieriaus spalvos pokytis ΔE. Fermentus iš popieriaus išplovus, spalvos pokytis sumažėja. 2 pav. matyti, kad pasendintų fermentų tirpalais paveiktų pavyzdžių popieriaus spalvos pokytis ΔE labai smarkiai išauga. Taigi neišplautas ir popieriuje likęs fermentas (baltymas) sendinamas stipriai keičia optines popieriaus savybes.

E
Fermento Fermentas Fermentas + Fermentas + Fermentas +
pavadinimas sendinimas plovimas plovimas +

sendinimas
Kontrolinė grupė 2,44
(be fermento)
 – amilazė 0,54 6,1 0,39 2,42
Promozyme 0,64 5,08 0,37 2,15
Gliukoamilazė 0,26 6,24 0,14 2,08
Alkalazė 0,58 1,98 0,43 1,8
Neutrazė 0,71 5,76 0,55 2,34

Po apdorojimo fermentų tirpalais praplautų ir tik po to pasendintų, spalvos pokytis ΔE praktiškai atitinka popieriaus spalvos pokytį atsiradusį dėl natūralaus celiuliozės senėjimo (kontrolinis – spalvos pokytis ΔE, atsiradęs sendinant dejonizuotu vandeniu apdorotą popierių).
Taigi: ΔEceliuliozė+fermentas+H2O,T ≈ ΔEceliuliozė+H2O,T
Vadinasi, galima teigti, kad tyrimui naudoti fermentai pakankamai gerai išsiplauna iš popieriaus, todėl neturi įtakos sendinamo popieriaus optinėms savybėms.

Buvo ištirta fermentų įtaka popieriaus rūgštingumui.
Remiantis gautais pH duomenimis (5 lent., 4 pav.), galima pastebėti, kad, apdorojus pavyzdžius fermentų tirpalais, popieriaus rūgštingumas padidėja nežymiai. Tačiau tokius pavyzdžius pasendinus, popieriaus rūgštingumas išauga pastebimai (išskyrus pavyzdžius, paveiktus alkalaze). Išplovus ir tik po to pasendinus fermentais paveiktus popieriaus pavyzdžius, pH reikšmių kitimas minimalus (paklaidos ribose), praktiškai atitinka kontrolinės grupės (popierius be fermento) reikšmes. Vadinasi, tyrimams panaudoti fermentai gerai išsiplauna iš popieriaus ir neturi įtakos sendinamo popieriaus rūgštingumui.

pH
Fermento Fermentas Fermentas + Fermentas + Fennentas +
pavadinimas sendinimas plovimas plovimas +

sendinimas
Kontrolinė grupė 8,7 8,5 8,6 8,4
(be fennento)
Fermento
pavadinimas

Fermentas Fermentas +
sendinimas

Fermentas +
plovimas

Fennentas +
plovimas +
sendinimas

 – amilazė 8,5 7,0 8,6 8,4
Promozyme 8,4 7,9 8,5 8,2
Gliukoamilazė 8,5 8,1 8,6 8,4
Alkalazė 8,7 8,5 8,7 8,6
Neutrazė 8,2 7,4 8,6 8,5

Remiantis optiniais tyrimais bei popieriaus rūgštingumo rodiklio pH duomenimis, galima teigti, kad panaudotus fermentus būtina gerai išplauti iš popieriaus. Po apdorojimo fermentų tirpalais popierių pakanka plauti 1 val., keičiant vonelėje vandenį mažiausiai tris kartus. Fermentai a-amilazė, promozyme, gliukoamilazė, alkalazė ir neutrazė gerai išsiplauna iš popieriaus ir neturi įtakos senstančio popieriaus rūgštingumui bei optinėms savybėms.

Ištirta galima fermentų įtaka popieriaus mechaniniam atsparumui. Popieriaus mechaninį atsparumą apibūdina keletas skirtingų rodiklių. Tai popieriaus atsparumas lankstymui, praspaudimui, tempimui, popieriaus paviršiaus atsparumas mechaniniam poveikiui ir kt. Naudojant fermentus popieriui konservuoti labai svarbu įsitikinti, kad fermentai bei fermentinių reakcijų produktai neardo celiuliozės, nemažina popieriaus mechaninio atsparumo. Siekiant ištirti galimą žalingą fermentų poveikį celiuliozei, įvertinti fermentų panaudojimo saugumą popieriaus (restauruojamo objekto) atžvilgiu, buvo atlikti popieriaus mechaninio atsparumo tyrimai. Mechaninis atsparumas buvo tirtas, matuojant popieriaus, apdoroto fermentų tirpaluose, atsparumą lankstymui. Popieriaus atsparumas lankstymui daugiausia priklauso nuo popieriaus plaušų tvirtumo ir ilgio, mažiau – nuo plaušų tarpusavio sukibimo. Tiriamo popieriaus juostelė perplyšta, dėl lankstymo nutrūkstant popieriaus plaušams. Buvo matuotas popieriaus dvigubų lenkimų skaičius, laikantis standarto GOST 13525-280. Dvigubų lenkimų skaičius parodo, kiek dvigubų lenkimų gali atlaikyti popieriaus juostelė prieš perplyšdama. Tyrimo metu naudotas prietaisas, pagamintas Ukrainos popieriaus mokslinio tiriamojo instituto eksperimentinėje-gamybinėje dirbtuvėje. Tyrimams naudotas rusiškas celiuliozės popierius „Marka B“. Popieriaus lapai po apdorojimo fermentų tirpaluose buvo supjaustyti pluošto išilgine kryptimi juostelėmis (105×15 mm). Popieriaus mechaniniam atsparumui įvertinti buvo atlikta po 20 kiekvieno pavyzdžio dvigubų lenkimų skaičiaus matavimų.

Taip pat neišplauti popieriuje likę fermentai bei fermentinių reakcijų produktai sendinami keičia popieriaus mechanines savybes, mažina popieriaus mechaninį atsparumą. Popieriaus pavyzdžių, po apdorojimo fermentų tirpalais praplautų ir po to pasendintų, mechaninio atsparumo sumažėjimas minimalus, patenka į eksperimento paklaidos ribas. Vadinasi, tyrimams panaudoti fermentai: α-amilazė, promozyme, gliukoamilazė ir alkalazė bei neutrazė, neveikia celiuliozės, gerai išsiplauna iš popieriaus ir neturi įtakos sendinamo popieriaus mechaninėms savybėms. Fermentai α-amilazė, promozyme, gliukoamilazė ir alkalazė bei neutrazė gali būti naudojami konservuojant popierių.

Išvados
1. Prieš naudojant fermentą būtma atidžiai išstudijuoti produkto aprašymą, susipažinti su detalia fermento charakteristika, įsitikinti, kad produkte nėra pašalinių priemaišų.

2. Remiantis optiniais tyrimais bei popieriaus rugštingumo matavimais galima teigti, kad fermentai α-amilazė, promozyme, gliukoamilazė bei alkalazė ir neutrazė gali būti naudojami konservuojant popierių. Galutiniam fermentų poveikio popieriui įvertinimui kitame šio darbo etape numatoma atlikti popieriaus mechaninio atsparumo tyrimus.
3. Konservuojant popierių turėtų būti naudojami minimalių koncentracijų fermentų tirpalai. Po apdorojimo fermentais popierių būtina gerai išplauti, nes fermento likučiai laikui bėgant nepageidautinai keičia popieriaus savybes.
4. Fermentai α-amilazė, promozyme, gliukoamilazė bei alkalazė ir neutrazė gerai išsiplauna iš popieriaus ir nekeičia senstančio popieriaus rūgštingumo bei optinių savybių.
5. Konservuojant popierių krakmolo klijams šalinti patartina naudoti krakmolą hidrolizuojančių fermentų mišinius. Fermentų mišinių tirpalai veikia efektyviau nei viena a-amilazė. Fermentų mišinys α-amilazė + promozyme + gliukoamilazė (1:1:1) veikia efektyviau nei α-amilazė + promozyme (1:1).
6. Tiek alkalazė, tiek neutrazė efektyviai hidrolizuoja baltyminės kilmės klijus. Remiantis optinių tyrimų bei pH matavimo duomenimis, konservuojant popierių tikslingiau naudoti fermentą alkalazę (terpės pH – 8).
7. Konservuojant popierių nėra būtina griežtai laikytis konkrečiam fermentui būdingų optimalių temperatūros ir pH reikšmių. Fermentai, kaip efektyvūs katalizatoriai, veiksmingi platesniame šių reikšmių intervale arba užtikrinus tik vieną iš šių sąlygų.

Literatūra
1. A. Praškevičius, J. Burneckienė, L. Ivanovienė; Fermentai ir vitaminai; Kaunas: Kauno medicinos universiteto Spaudos ir leidybos centro leidykla, 2001
2. R. Makuška, S. Budrienė, Cheminės technologijos procesų modeliavimas, Vilnius: VU, 2000
3. E. Grinienė, Biochemija, Kaunas: Technologija,1998.
4. Internetas

Leave a Comment