1. Nukleino rūgščių komponentų struktūra, sąvybės, cheminė sintezė.
· Nukleozidai
· Nukleotidai
· Oligonukleotidai
2. Nukleino rūgščių struktūra.
· DNR struktūra
· Pirminė DNR struktūra
· Antrinė DNR struktūra
· Tretinė DNR struktūra
· RNR struktūra
· Pirminė RNR struktūra
· Antrinė RNR struktūra
· Tretinė RNR struktūra
1. Nuklino rūgščių komponentų struktūra, savybės, cheminė sintezė
Nukleino rūgštys yra nepaprastai sudėtingos didelės molekulinės masės polimerinės molekulės. Jų yra dvejų tipų – dezoksiribonukleino rūgštys (DNR) ir ribonukleino rūgštys (RNR). Hidrolizuojant nukleino rūgštys neorganinėmis rūgštimis, susidaro visiškos hidrolizės produktai – heterociklinės bazės, monosacharidai ir fosforo rūgšties liekana. Svarbiausios hetero ciklinės bazės yra piramidinai ir purinai. Jos iš nukleino rūgščių hidrolizatų buvo išskirtos dar praeito amžiaus pabaigoje. Pirimidinais pirmasis pavadino vokiečių mokslininkas A. Koselis, o purinais – vokiečių mokslininkas E. Fišeris. Šie mokslininkai daug pasidarbavo pirimidinio ir purinio bazių struktūros tyrimo bei sintezės srityje. Nukleino rūgščių sudėtyje yra pagrindinės penkios heterociklinės bazės: urcilas, citozinas, timinas (pirimidinio bazės) ir adeninas, guaninas (purino bazės). Sutrumpintai uracilas žymimas Ura, citozinas – Cyt, timinas – Thy. Purinas sudarytas iš kondensuotų pirimidinio ir imidazolo žiedų. Sutrumpintai adeninas žymimas Ade, guaninas – Gua.
Paprastai DNR sudėtyje būna timinas, citozinas, adeninas ir guaninas, o RNR – vietoj timino – uracilas. Visos šios heterociklinės bazės labai paplitusios nukleino rūgštyse ir vadinamos pagrindinėmis heterociklinėmis bazėmis. Be šių bazių kai kuriose nukleino rūgštyse aptinkama truputis netipiškų heterociklinių bazių, kurio vadinamos minorinėmis. Daugiausia jų transportinėse RNR (tRNR). Iš viso tRNR rasta daugiau kaip 60 įvairių minorų.
Kadangi heterociklinės bazės turi keto grupių, galima jų sparti grįžtamoji izomerizacija, kuri vadinama tautomerija. Yra žinoma dvi galinčios virsti viena kita tautomerinės formos – laktaminė-laktiminė ir enamininė-ketiminė.
Heterociklinės bazės dažnai turi po dvi keto, arba amino ir keto grupes. Čia galimos kai kurios teorinės tautomerinės formos. Pvz., uracilas gali būti keturių tautomerinių formų.
Kokios tautomerinės formos heterociklinės bazės buvo tiriama UV, IR, BMR spektroskopija. Heterociklinės bazės, įeinančios į nukleino rūgščių sudėtį, buvo lyginamos su įvairiais alkilintais jų dariniais. Ištyrus nustatyta, kad ištirpintos heterociklinės bazės būna laktaminės ir enamininės formos.
RNR sudėtyje aptinkama D-ribozė, o DNR – D-2-dezoksiribozė.
Nukleino rūgštyse D-2-dezoksiribozė būna ciklinės furanozinės formos. Kai kurių DNR minorinis komponentas yra D-gliukozė, o RNR – 2-0-metil-D-ribozė.
Taigi į visų nukleino rūgščių sudėtį įeina trys pagrindiniai komponentai: heterociklinės bazės, monosacharidas bei fosforo rūgšties liekana.
Nukleozidai
Nukleino rūgščių sudėtyje yra du pagrindiniai nukleozidų tipai – ribonukleozidai (RNR) ir dezoksiribonukleozidai (DNR). Į RNR sudėtį įeina heterociklinė bazė ir D-ribozė, į DNR – heterociklinė bazė ir D-2-dezoksiribozė. Priklausomai nou heterociklinės bazės prigimties visi nukleozidai skirstomi į pirmidininius ir purininius. Nukleozidus galima išskirti iš nukleino rūgščių hidrolizatų arba susintetinti cheminiais metodais. Virinant RNR praskiestame amoniake arba vandeniniame piridino tirpale susidaro ribonukleozidai. Tarpiniai hidrolizės produktai – ribonukleotidai. Dezoksiribonukleozidai gaunami hidrolizavus DNR fermentais.dažnai naudojami gyvčių nuodai, kuriuose yra įvairių fosfodiesterazių ir fosfomonoesterazių.
Kai kurie nukleozidai būna laisvi ir juos galima išskirti ekstrakcija.
Iš nukleino rūgščių hidrolizatų nukleozidai paprastai išskiriami jonitinės chromatografijos metodais. Jie identifikuojami UV spektroskopijos, mas-spektrometrijos ir kitais metodais.
Norint nustatyti nežinomo nukleozido struktūrą reikia išsiaiškinti: heterociklinės bazėsir monosacharido prigimtį; heterociklinės bazės atomus, prie kurių jungiasi monosacharidas; monosacharido žiedo dydį; glikozidinio centro konfiguraciją.
Galutinai D-ribozės struktūra buvo įrodyta jos cheminės sintezės būdu. D-dezoksiribozė išskirta 1929 m. Ji labilesnė už D-ribozę, todėl išskirti ir įrodyti jos struktūrą buvo sunkiau. Kad galima būtų išaiškinti nukleozido heterociklines bazės ir monosacharido prigimtį, paprastai jis rūgštimi suskaidomas iki heterociklinės bazės ir monosacharido. Jie identifikuojami chromatografiniais ir spektrofotometriniais metodais. Sudėtingiau identifikuoti minorines heterociklines bazes, kurių struktūra būna labai sudėtinga. Todėl naudojami tobuliausi organinių junginių tyrimo metodai.
Heterociklinių bazių sudėtyje yra anglies, azoto ir deguonies. Monosacharidų labai reaktyvūs yra pirmas – glikozidinis anglies atomas. Todėl teoriškai tarp heterociklinių bazių ir monosacharido gali susidaryti C-C, C-O arba C-N jungtis. Ištyrus gamtinių nukleozidų stabilumą vandeniniuose tirpaluose, nustatyta, kad jie skyla esant rūgščiai aplinkai. Taigi C-C jungties variantas netinka, nes žinoma, jog tokio tipo jungtys yra labai stabili. Kita vertus, buvo nustatyta, kad pirimidinių nukleozidų hidrolizei reikalingos gana griežtos sąlygos. Be to, žinoma, kad O-glikozidai labai labilūs. Taip paaiškėjo, kad gamtiniai nukleozidai yra N-glikozidai, t. y. monosacharidas jungiasi prie vieno iš heterociklinės bazės azotų.
Nukleino rūgštyse nedideliais kiekiais aptinkama netipiškų, modifikuotų, arba dar vadinamų minoriniais, nukleozidų. Tai nukleozidai, į kurių sudėtį įeina minorinės hetrociklinės bazės, kartais 2´-O-metilinta D- ribozė. Minorinių nukleozidų aptinkama DNR, rRNR, eukariotų iRNR. Ypač daug minorinių nukleozidų būna tRNR. Iš įvairių tRNR išskirta ir identifikuota per 60 minorinių nukleozidų. Dauguma jų turi modifikuotų heterociklinių bazių. Minoriniai nukleozidai susidaro veikiant fermentams tRNR arba jos pirmtakus. Labiausiai paplitę – pseudouridinas, dihidrouridinas, metilinti, supermodifikuoti nukleozidai ir kt.
Jei visi į nukleino rūgščių sudėtį įeinantys nukleozidai yra N-glikozidai, tai pseudouridinas yra vienintelis iš nukleino rūgščių išskirtas nukleozidas, kuriame monosacharidas jungiasi prie heterociklinės bazės prie jos anglies atomas (C-glikozidas). Pseudouridino struktūra buvo tyrinėjama net 10 metų.
Minorinių nukleozidų aptinkama ir DNR.
Kai kurių virusinių DNR sudėtyje vietoj dezoksiribozės būna nedaug D-gliukozės. Apskritai minorinių nuklozidų DNR gerokai mažiau negu RNR. Dar nepakankamai gerai žinomos minorinių nukleozidų funkcijos. Nustatyta, kad metilinti DNR komponentai yra reguliatoriniai signalai.
Nukleozidai, neįeinantys į nukleino rūgščių sudėtį: nebularinas, kordicepinas, tubercidinas, puromicinas.
Vienas iš faktorių, lemiančių nukleino rūgščių sąvybes, biologinį specifiškumą, yra į jų sudėtį įeinančių struktūrinių erdvinis išsigėstymas. Tokie struktūriniai nukleino rūgščių elementai yra nukleozidai. Hetrociklinėms bazėms būdinga aromatinė sistema, todėl jų struktūra plokščia. Nukleozidų monosacharidai yra voko formos, kurioje ir atomai per 0,05 nm būna išsikišę į vieną arba kitą pentozės plokštumos pusę.
Nukleozidai – tai baltos, kristalinės, blogai tirpstančios vandenyje medžiagos. Nukleozidų sudėtyje yra monosacharidų, todėl jie – optiškai aktyvūs junginiai. Nukleozidų hetero ciklinės bazės lemia jų gebėjimą sugerti ultravioletinius spindulius. Rūgštinėje aplinkoje nukleozidų heterociklinės bazės protonizuojasi.
Visas chemines nukleozidų reakcijas galima suskirstyti į tris grupes: 1) kai reguoja nukleozidų hetero ciklinės bazės; 2) monosacharidai; 3) heterociklinės bazės bei monosacharidai tarpusavyje.
Nukleotidai
Nukleotidai yra nukleozidų fosfatai. Iš jų sudarytos nukleino rūgštys, tad nukleotidai paprastai gaunami jas hidrolizuojant. RNR hidrolizuojant šarmais gaunama nukleozid-2´-fosfatų ir 3´-fosfatų mišinys. Paveikus DNR arba RNR įvairiais fermentais, susidaro ir nukleozit-5´-fosfatų. Nukleino rūgščių hidrolizės produktai rodo, kad fosforo rūgšties liekana nukleotiduose gali jungtis prie nukleozidų 2´-hidroksilo, 3´hidroksilo arba 5´-hidroksilogrupių.
Jei fosforo rūgšties liekana jungiasi prie ribonukleozidų, turime ribonukleotidus, jei prie dezoksiridonukleozidų – dezoksiribonukleotidus. Pirmieji yra RNR monomerai, antrieji – DNR monomerai. Jei fosforo rūgštes liekana jungiasi prie adenozino 5´-hidroksilogrupės – turime uridin-2´-fosfatą, jei prie deksitimino 3´-hidroksilo grupės – dezoksitimin-3´-fosfatą.
Minorinių nukleozidų fosfatai vadinami minoriniais nukleotidais.
Nukleotidai įeina ne tik į nukleino rūgščių, bet ir į nukleotidinių kofermentų nikotinamidadenindinukleotido (NAD+). Jo fosforilinto analogo NADP+, flavinadenindinukleotido (FAD), kofermento A (CoA)ir kt. sudėtį. Organizme būna ir laisvų nukleotidų. Nukleotidais vadinami ir nukleozid-5´-difosfatai ir trifosfatai. Šie nukleozid-5´-trifosfatai (ATP).nukleozit-5´-trifosfatai yra nukleino rūgščių biosintezės substratai.
Nukleotidų heterociklinių bazių bei monosacharidų cheminės savybės analogiškos nukleozidų sudėtinių dalių savybėms. Nukleotidų ir nukleozidų cheminių savybių skirtumą lemia nukleotidų fosforo rūgšties liekana.
Anksčiau nukleotidų sintezė buvo labai svarbi nukleino rūgščių chemijos sritis, nes šiuo būdu buvo galutinai patvirtinta gamtinių nukleotidų struktūra. Dabar pagrindiniai nukleotidai išskiriami iš DNR ir RNR hidrolizatų. Cheminiais metodais sintetinami minoriniai bei įvairūs negamtiniai nukleotidai.
Nukleotidų sintezė – tai nukleozidų hidroksilo grupių fosforilinimas. Kadangi nukleozidai turi keletą funkcinių grupių, tai pirmiausia reikia blokuoti tas grupes, kurių nereikia fosforilinti. Paprastai nukleozidų funkcinės grupės blokuojamos alkilinimo ir acilinimo reakcijomis.
Oligonukleotidai
Oligonukleotidai yra sudėtingi organiniai junginiai, sudaryti iš kelių ar keliasdešimt mononukleotidų. Taigi mononukleotidai yra ologonukleotidų monomerai. Oligonukleotidai, sudaryti iš dezoksiribonukleotidų, vadinami oligodezoksiribonukleotidais, o iš ribonukleotidų – oligoribonukleotidais. Biologiniu požiūriu yra svarbūs oligonukleotidai, kurių monomerai susijungę taip, kaip ir nukleino rūgščių monomerai. Tai nepaprastai svarbi organinių junginių grupė,nes jos struktūra panaši į nukleino rūgščių. Sintetiniai oligonukleotidai buvo pritaikyti kryptingoms DNR mutacijoms gauti, jie plačiai naudojami baltymų biosintezei mechanizmui tirti, genams išskirsti, kai kurioms genetinėms ligoms aptikti ir kt.
Sintetinami kai kurių nesudėtingų baltymų genai ir paprasčiausios nukleino rūgštys. Norint susintetinti oligonukleotidus reikia: blokuoti funkcines grupes, kurios nedalyvauja susidarant tarpnukleotidinei jungčiai; aktyvuoti fosforo rūgšties liekaną; iš dalies ar visiškai pašalinti blokuotes; išskirti produktą ir įrodyti jo struktūrą. Yra du pagrindiniai tarpnukleotidinės jungties formavimo būdai: fosfodiesterinis ir fosfotriesterinis.
G. Korana pirmasis chemiškai susintetintiems oligodezoksiribonukleotidams jungti panaudojo DNR ligazę ir pasiūlė genų sintezės strategiją. Šios strategijos pagrindiniai principai tokie: cheminiu būdu susintetinami oligodezoksiribonukleotidai, kurių minimalus ilgis 8 – 10 nukleotidų. Vieno iš oligonukleotidų 5´-hidroksilo grupę fosforilina fermentas polinukleotidkinezė ir ATP.
2. Nukleino rūgščių struktūra
DNR struktūra
DNR – nepaprastai svarbūs polimerai, esantys visų gyvų organizmų ląstelėse ir daugumoje virusų. Eukariotinių ląstelių branduolyje lokalizuota DNR, sauganti informaciją, reikalingą organizmo vystymuisi ir medžiagų apykaitai. DNR paprastai būna susijungusi su baltymais, tokie kompleksai vadinami nukleoproteidais. Iš jų sudarytos chromosomos. Chromosomoje išsidėsčiusi viena dvispiralė DNR makromolekulė. Įvairių organizmų ląstelių branduoliuose chromosomų yra 1 (arklio, askaridės, gametų) iki 600 (dumblio Netrium digitus). DNR būna ir kai kuriuose organoiduose – mitochondrijose, chloroplastuose. Ši DNR replikuojasi nepriklausomai nuo branduolioDNR, joje saugoma ne tokia svarbi informacija. Be to, eukariotų citoplazmoje ir mitochondrijose aptikta DNR, panaši į bakterijų plazmidę.
Prokariotų ląstelių branduolio ekvivalente yra tik viena DNR makromolekulė. Jos funkcijos tokios pačios, kaip ir eukariotų chromosominėmis DNR, todėl ji dar vadinama chromosoma arba genomu. Be to, bakterijose aptinkamos trumpos žiedinės dvispiralės DNR, kurios replikuojasi dažniausiai nepriklausomai nuo genomo ir kuriose būna tik keli (arba net nė vieno) genai. Jos vadinamos plazmidėmis.
Pirmą kartą DNR išskyrė šveicarų mokslininkas F. Mišeris 1868 m. tačiau tai buvo ne gryna medžiaga, o DNR ir baltymų kompleksas, dabar vadinamas nukleoproteidu. Labai negreitai buvo nustatyta šios medžiagos struktūra ir jos biologinės funkcijos.
DNR – tai didelės molekulinės masės biopolimeras. Jo monomerai yra keturi skirtingi nukleotidai (pdA, pdG, pdC, pdT). DNR molekulinė masė ir kitos sąvybės labai priklauso nuo organizmo, iš kurio ji išskirta.
Tiksli eukariotų branduolių DNR molekulinė masė nežinoma. Matyti, tai labai heterogeninės DNR ir jas gauti individualias yra labai sunku. Sudėtingos DNR suyra net nuo hidrodinaminių, mechanizmų daltonų. Aišku tai, kad kuo sudėtingesnis organizmas, tuo didesnės molekulinės masės jo DNR. Jei bakteriofago ?X174 DNR yra tik 11 genų, tai bakterijos E. coli DNR – apie 4000.
Pirminė DNR struktūra
Nepriklausomai nuo to, iš kokio objekto būtų išskirta DNR, jos monomerai yra dezoksiribonukleotidai. Kyla klausymas, kaipkaip tie monomerai jungiasi į didžiules polimeines DNR molekules? Kaip ribonukleotidai susijungę rnr molekulėse, nustatyta šarminės RNR hidrolizės būdu. Nustatyta, kad DNR šarmuose neskyla, nes jų pontezės – dezoksiribozės – likanoje nėra 2´-hidroksilo grupės. Todėl tiriant DNR tarpnukleotidinėsjungties prigimtį svarbiausi fermentai fosfodiesterazės. Paveikus DNR gyvačių nuodų fosfodiesteraze, susidarė dezoksiribonukleozid-3´-fosfatai. Hidrolizavus DNR silpna rūgštimi pavyko išskirti stabilesnius, pirimidinius, dezoksiribonukleozid-3´,5´-difosfatus (pdNp). Visą tai rodo, kad fosfodiesterines jungtis sudaro dezoksiribonukleozidų 3´-hidroksilo ir 5´-hidroksilo grupės. Taigi DNR monomerai nukleotidai susijungę 3´?5´ fosfodiesterine jungtimi, kaip ir RNR monomerai. Polinukleotidinės grandinės monomerų seka (nuoseklus išsidėstymas) vadinama nukleino rūgščių pirmine struktūra, reikia: 1) išskirti gryną DNR; 2)išskirti DNR arba jos fragmentų nukleotidinę seką.
Natyvią DNR išskirti įmanoma tik iš virusų, bakteriografų, kai kurių mikroorganizmų bei organelių. Skiriant DNR iš kitų objektų, jos gerokai suyra. Todėl paprastai išskiraimi DNR fragmentai. Tokie fragmentai yra operatoriai, promotoriai, atskiri genai ir kt. operatorius – tai ta DNR dalis, kuri sąveikauja su baltymais represoriais. Promotorius – DNR dalis, su kuria kontaktuoja RNR polimerazė vykstant transkripcijos iniciatyvai. Paaiškėjo, kad galima išskirti šiuos svarbius DNR fragmentus. Dėl to DNR ir represoriaus arba RNR polimerazės kompleksas veikiamas pankreatine dezoksiribonukleaze. Šis fermentas hidrolizuoja baltymais nepadengtas DNR zonas ir lieka operatoriaus-represoriaus arba promotoriaus – RNR polimerazės kompleksai. Pašalinus baltymus galima gauti gryną operatorių arba promotorių ir tirti jų pirminę struktūrą. Kai kurie genai turi po keletą promotorių. Taigi susidaro kelių promotorių mišinys, kurį vėliau reikia frakcionuoti. Panašei tenka atskirti ir operatorius. Kai kurios DNR turi po du operatorius , sąveikaujančius su tuo pačiu represoriumi. Šią problemą pavyko išspręsti panaudojant mutantus, turinčius mutacijas tik viename iš dvejų operatorių. Mutavę operatoriai nesąveikauja su represoriais. Labai dažnai išskiriami eukariotinių DNR genai, koduojantys tam tikrus baltymus. Individualių genų išskyrimas svarbus ne tik DNR pirminės struktūros tyrimo, bet ir genų inžinerijos požiūriu. Pavyzdžiui, galima panagrinėti histonų genų išskyrimą. Žinomos septynios skirtingų histonų klasės. Eukariotų genome tokių genų labai daug. Jūros ežio histonų genų apie 300-1000 kopijų ir sudaro 0,3% viso genomo. Jūros ežio histonų genai turi daug G-C porų ir skiriasi nuo kitų DNR fragmentų tankiu. Taigi centrifuguojant tankio gradiente galima frakcionuoti DNR fragmentus, kurie susidaro išskiriant DNR. Tie fragmentai ne didesni kaip histonų genai.
Gana dažnai iškiriami ne patys genai, o iRNR. Iš iRNR, panaudojus atvirkštinę transkriptazę, gaunama komplementai DNR (cDNR), faktiškai iRNR-DNR hibridas. RNR hidrolizuojama šarmu, o viengrandinė DNR, veikiant E. coli DNR polimerazei I, virsta dvigrandine. Taip iš iRNR gaunama dvigrandinė cDNR, kurios nukleotidinę seką reikia nustatyti. Kadangi cDNR gaunama labai mažai, tai paprastai cDNR įterpiama į plazmidę, o ši transformacijos būdu patenka į E. coli ir ten dauginasi. Toliau iš E. coli plazmidės restriktazės iškerpa cDNR ir gaunama pakankamai DNR fragmentų. Taip buvo gauti insuliną, globiną ir kai kuriuos baltymus koduojantys genai. Nustačius jų nukleotidinę seką, galima laisvai sužinoti tuos baltymus koduojančių iRNR seką.
Dar visiškai neseniai DNR pirminės struktūros tyrimas buvo nepaprastai sudėtingas uždavinys. 1973-1974 m. DNR fragmento iš 20 monomerų seką nustatyti reikėdavo dvejų metų. Dabar tai atliekama per dieną. Kas lėmė tokią greitą pažangą? Pirmiausia tai, kad atradus specifines endonukleazes (restriktazes), DNR galima suskaidyti į nedidelius fragmentus. Antra, patobulėjo elektroforezės poliakrilamidiniuose geliuose metodas, įgalinęs gerai funkcionuoti oligonukleotidinius fragmentus, besiskiriančius grandinės ilgiu. Trečia, genų inžinerijos metodais gaunama pakankamai genų arba kitų DNR frgmentų, kurie būtini nustatyti DNR seką. Be to, buvo pasiūlita naujų metodų tirti nukleotidines sekas DNR fragmentuose. Dabar DNR pirminę struktūrą tirti lengviau negu RNR arba baltymų. Todėl gana dažnai, nuustačius genų nukleotidinę seką, žinant genetinį kodą, rekonstruojama to geno koduojamo baltymo amino rūgščių seka.
Per pastaruosius 7-8 metus pasiekta didžių laimėjimų tiriant DNR pirminę struktūrą. Nustatyta daugiau kaip 1,5 milijono nukleotidų seka įvairiuose DNR arba jų fragmentuose. Kodėl svarbu žinoti DNR pirminę struktūrą? Pirmiausia, žinant struktūrą, galima geriau suprasti DNR funkcijas. Buvo manoma, kad genai DNR molekulėse išsidėstę vienas po kito. Išskyrus bakteriofago ?X174 ir kitų objektų DNR nukleotidų seką paaiškėjo, kad vieni genai gali būti įsiterpę į kitus, ir jie gali susikloti. Tik išskyrus daugelio eukariotinių DNR genų nukleotidines sekas buvo patvirtinta introninė-egzoninė eukariotinių genų sandara. Išnagrinėjus kai kurių mitochondrijų DNR pirminę struktūrą buvo nustatyta, kad tam tikrų amino rūgščių genetinis kodas neuniversalus. Neįmanoma suprasti nukleino rūgščių ir baltymų atpažinimo principų nežinant tikslios nukleino rūgščių struktūros. Nustačius operatorių, promotorių nukleotidines sekas paaiškėjo ir jų sąveika su represoriais ir RNR polimerazėmis.
Antrinė DNR struktūra
Tiriant erdvinę DNR makromolekulės struktūrą labai svarbus rentogenostruktūrinės analizės metodas. Pirmą kartą DNR natrio druskos pluošto rentgenogramą 1938 m. gavo anglų mokslininkas V. T. Astberis. Kadangi tyrimams buvo panaudota ne DNR kristalai, o pluoštinė struktūra, tai metodo skiriamoji geba buvo ribota. Iš tų nekokybiškų rentgenogramų Astberis nustatė, kad DNR sudaryta iš tvarkingai (kas 0,34 nm) pasikartojančių monomerų. Vėliau DNR pluoštus rentgenostruktūrinės analizės metodu tyrinėjo R. Franklin ir M. H. F. Vilkinsas. Jie gavo kokybiškas rentgenogramas ir manė, kad DNR susisukusi į spiralę, kurios žingsnyje telpa 10 nukleotidų. Labai svarbų vaidmenį aiškinantis DNR antrinę struktūrą suvaidino E. Čargofo atlikti DNR nukleotidinės sudėties tyrimai. Kaip tiriama DNR nukleotidinė sudėtis? Paprastai DNR molekulė 70% perchloro rūgštimi (100 oC, 1 val.) suskaidoma į heterociklines bazes ir nustatoma hidrolizatų sudėtis.
E. Čargafas, išanalizavęs kai kurių DNR nukleotidinę sudėtį, pastebėjo tris dėsningumus, kurie dabar vadinami Čargafo principais:
1. Purininių ir pirimidinių bazių skaičius DNR yra vienodas (Ade+Gua=Cyt+Thy).
2. Visose DNR adenino yra tiek, kiek ir timino (Ade=Thy), o guanino – kiek citozino (Gua=Cyt).
3. Heterociklinių bazių, prie kurių C(6) atomo prisijungusi amino grupė ir heterociklinių bazių, prie kurių C(6) arba C(4) atomo prisijungusi okso grupė, yrapo lygiai (Ade+Cyt=Gua+Thy).
Remdamiesi DNR pluošų rentgenostruktūrinės analizės duomenimis, DNR nukleotidinės sudėties bei kitais tyrimais 1953 m. Dž. Votsonas ir F. Krikas pasiūlė garsųjį DNR struktūros modelį. Svrbu tai, kad minėti mokslininkai ne tiktai pasiūlė DNR struktūros modelį, bet ir aiškino, kaip tokia DNR gali replikuotis. Jie teigė, kad DNR sudaryta iš dviejų polinukleotidinių grandinių, susuktų dešiniojo sukimosi spirale apie tariamą ašį. Šias grandines jungia vandenilinės jungtys, kurios susidaro tarp heterociklinių bzių. Adeninas sudaro dvi vandenilinias jungtis su timinu, o guaninas – tris vandenilinias jungtis su citozinu. Šis sąveikos tipas vadinamas Votsono-Kriko sąveika.
Aišku, kad vienos polinukleotidinės grandinės nukleotidų seka lemia kiros grandinės seką. Tokios grandinės vadinamos komplementariomis. Atstumas tarp polinkleotidinių grandinių – 2 nm. Jos antilygiagrečios. Dvispiralinės struktūros viduje yra statmenos ašiai heterociklinės bazės, o išorėje – fosfodezoksiribozinis karkasas. DNR antrinės struktūros stabilumui be vandenilinių jungčių svarbios stekingo jėgos.
Ne visos DNR yra dvispiralinės linijinės struktūros. Kai kurių bakteriofagų (?X174, M13, fd, f2, G4 ir kt.) DNR yra viengrandinės žiedinės uždaros formos. Labai paplitusios yra dvispiralės žiedinės DNR. Jo būna dviejų tipų. Vieno tipo žiedinę stuktūra formuoja linijinė dvigrandinė DNR aptinkama su lipniais galais. Tokia fago ? DNR. Kito tipo žiedinė DNR uždara. Tokia DNR aptinkama mitochondrijose, chloroplastuose, bakterijose, virusuose. Plazmidės taip pat yra dvigrandinės uždaros žiedinės DNR. Viengrandinės žiedinės fagų DNR, patekusios į ląstelę-šeimininkę, yra verčiamos replikacinės formos DNR. Ši forma taip pat dvispiralinė žiedinė uždara DNR.
Abi žiedinių DNR grandinės palaiko sąveiką tarp komplementarių bazių. Žiedinės DNR pirmą kartą buvo pastebėtos pro elektroninį mikroskopą.
Tretinė DNR struktūra
Tretinė DNR struktūra – tai žiedinių dvispiralinių uždarų DNR superspiralizacija bei mazgo pavidalo DNR ir katenanų susidarymas. Neseniai pastebėta, kad superspiralizuotis gali ir linijinės dvigrandinės DNR, jei jų galai prisitvirtinę prie kokio nors baltymo ar membranos. Superspiralinių domenų aptikta ir eukariotų ląstelių branduolio DNR. Dvi žiedinės viengrandinės komplementarios DNR, sudarydamos žiedinę uždarą struktūrą, susijungia. Paprasčiausiai du žiedai vieną kartą susiveria. Natyviose žiedinėse DNR dvi žiedinės DNR susikibusios daug kartų. Dviejų žiedinių DNR sukibimų skaičius vadinamas sąryšos laipsniu Lk.
Lk yra svarbus ir pastovus dydis tam tikrai žiedinei DNR. Pažeidus DNR žiedą, Lk gali pakisti.
Neseniai iš bakterijos Escherichia coli buvo išskirtas fermentas DNR girazė, kuri katalizuoja keletą reakcijų.
Pastaraisiais metais panašių fermentų išskiria ir iš kitokių objektų. Visi šie fermentai pavadinti topoizomerazėmis II, nes nutraukia abi žiedines DNR grandines. Visos prokariotų ir eukariotų topoizomerazės II katalizuoja neigiamai superspiralizuotų DNR susidarymą. Išimtis – tik vienas fermentas iš archebakterijų Sulfolobus, pavadintas atvirkštine giraze, nes suska žiedinę dvigrandinę DNR į teigiamai superspiralinę struktūrą. Kita šių fermentų grupė – topoizomerazės I. Jos taip pat katalizuoja kai kurias reakcijas, susietas su DNR topologijos pokyčiais.
Nseseniai nustatyta, kad DNR susisukant superspirale, kartais susidaro “kryžiai”. Tokios struktūros susidaro ligų palindromų lokalizacijos vietoje. Nustatyta, kad tokia kryžiaus pavidalo tikrai susidaro superspiralizuotoje ColE1 plazmidėje. Tokių struktūrų susidarymo tikimybė linijinėse molekulėse lygi 10-15, t.y. artima nuliui.
Taigi tretinės struktūros požiūriu DNR gali būti superspiralinės, mazgo pavidalo, katenano ir kryžiaus tipo struktūros. Kadangi daugumos tokių struktūrų susidarymą katalizuoja fermentai, galima teigti, kad jos egzistuoja organizme.
RNR struktūra
Įvairiuose organizmuose aptinkama labai įvairių RNR. Pagrindinės jų trys: ribosominės, transportinės ir informacinės. Kiekybiniu požiūriu daugiausia ribosominių RNR (rRNR). Jos sudaro maždaug 80% visų ląstelės RNR. Ribosominės RNR vadinamos todėl, kad jos įeina į ribosomų sudėtį. Prokariotų ribosomose aptinkama 5S, 5,8S, 18S ir 28S rRNR. Universaliausia yra 5S rRNR, kuri aptinkama tiek prokariotų, tiek eukariotų ribosomose. Mitochondrijų rRNR gana platus sedimentacijos konstantų diapazonas. Jų ribosomose visiškai nėra 5S rRNR. Daugelis chloroplastų turi 4,5S rRNR, o vabzdžių – 2S rRNR. Transportinė RNR (tRNR) sudaro 10% visų ląstelės RNR. Struktūriniu požiūriu tai pačios paprasčiausios ląstelės RNR. Jų sedimentacijos konstanta 4S ir sudarytos iš 75-93 mononukleotidų. Apie 5% ląstelinių RNR sudaro informacinės arba matricinės RNR (iRNR arba mRNR). Jos labai heterogeniškos, sedimentacijos konstanta 4-30S.
Visų anksčiau minėtų RNR pirmtakai ląstelių brandoluose. Šių pirmtakų molekulinė masė gerokai didesnė negu aptinkamų citoplazmoje RNR. Šie citoplazminių RNR pirmtakai sudaro branduolinių heterogeninių RNR grupę (hnRNR).
Neseniai ląstelių brandoliuose aptikta mažos molekulinės masės RNR (suRNR). Jos geba iš branduolio patekti į citoplazmą ir atgal.
Šių RNR sedimentacijos konstanta 4-8S. Jų gana daug, t. y. 2-3% visų ląstelės RNR. Atskirą grupę sudaro organelių RNR. Mitochondrijos, chloroplastai turi savo autonomines ribosomines, transportines bei informacines RNR.
Kai kurių virusų sudėtyje yra RNR. Tai virusinių RNR grupė. Gana didelė virusinių RNRgrupė 5´-gale turi kovalentiškai prisijungusį baltymą. Daugelis virusinių RNR yra viengrandinės molekulės. Tačiau kai kurių virusų, pvz.,reovirusų RNR dvigrandinė.
Įdomią RNRgrupę sudaro viroidai. Tai žiedinės RNR, sukeliančios kai kurių augalų patologiją.
Mielėse rasta dvispiralinė RNR.
Taigi gyvajame pasaulyje aptinkama labai įvairių RNR. Kokia jų struktūra.
Pirminė RNR struktūra
1927 m., remdamasis potenciometrinio titravimo duomenimis, P. A. Levinas nustatė, kad nukleino rūgščių monomerai jungiasi taip, kad prie fosforo rūgšties liekanos būna viena laisva, gebanti disocijuoti grupė. Tačiau tarp kokių nukleotidų atomų ši jungtis susidaro, nebuvo žinoma iki penktojo šio amžiaus dešimtmečio. Kadangi nukleino rūgščių heterociklinių bazių amino grupės gali būti dezaminintos, tai galima manyti, kad, susidarant tarpnukleotidinei jungčiai, nedalyvauja adenino, guanino ir citozino amino grupės. Taigi RNR tarpnukleotidinę jungtį sudaro nukleotidų fosforo rūgšties liekana ir kito monomero ribozės hidroksido grupė. Detaliau tarpnukleotidinė jungtis buvo tiriama cheminės ir fermentinės RNR hidrolizės būdais. Dar 1949 m. V. Konas nustatė, kad RNR lengvai skyla šarmuose. Šarminės RNR hidrolizėsb produktais buvo ribonukleotid-3´-fosfatų ir ribonukleozit-2´-fosfatų mišinys. Pavaekus RNR gyvačių nuodų fosfodiesteraze susidaro ribonukleozid-5´-fosfatai.
Nustatant ar RNR aptinkamas vienas iš šių dviejų galimų tarpnukleotidinės jungties varijantų, arba du, buvo panaudoti du fermentai: pirimidinėse ribonukleazė ir blužnies fosfodiesterazė.
Sudėtingiausia, tiriant RNR pirminę struktūrą, yra nustatyti nukleotidinę seką.
RNR pirminei struktūrai tirti buvo panaudotas ir Maksomo-Gilberto cheminės modifikacijos metodas, kuris buvo taikomas tiriant DNR seką. Metodo principas tas, kad cheminiais metodais galima specifiškai modifikuoti atskiras RNR heterociklines bazes ir modifikuotų bazių vietoje suskaidyti pilinukleotidinę grndinę. Taigi specifiniam žymėtų RNR skaidymui galima panaudoti ne įvairias ribonukleazes, o cheminius reagentus.
RNR pirminė struktūra nulemia jų savybes bei funkcijas, makromolekulinę struktūrą. Išaiškinus daugiau kaip 260 tRNR nukleotidinę seką, nustatyta, kad į tRNR sudėtį įeina per 60 minorinių nukleozidų.
RNR nukleotidinę seką būtina žinoti tiriant RNR ir baltymų sąveikos problemas.
Labai svarbu žinoti nukleino rūgščių seką aiškinantis jų evoliucijos ir net organizmų sistematikos klausimus.
Ištyrus įvairių objektų rRNR pirminę struktūrą, išskirta trečia evoliucijos atšaka – archebakterijos.
Antrinė RNR struktūra
Daugelis RNR turi po vieną polinukleotidinę grandinę, tačiau jos niekada nebūna linijinės formos. Iki 1959 m. duomenų apie RNR antrinę struktūrą nebuvo. Tada jau buvo atrastą ?-spiralinė baltymų struktūra ir žinoma, kad polipeptidinės grandinės spirališkumas keičia baltymo optines savybes. RNR, kaip ir DNR, optinės savybės nėra vien tik monomerų optinių sąvybių suma. Nustatyta, kad keliant temperatūrą, RNR tirpalo optinis tankis didėja. Šis efektas vadinamas hiperchrominiu efektu. Temperatūra, kuriai esant denatūruojasi 50% RNR molekulių, vadinama lydymosi temperayūra. Taigi RNR, kaip ir baltymai, turi antrinę struktūrą. Keliant temperatūrą ji suyra. Kadangi RNR neturi griežtai išreikštos lydimosi temperatūros, tai rodo, kad spiralinė ne visa RNR, o tik kai kurie jos fragmentai. Tarybinis akademikas A. Spirinas ir amerikietis P. Dotis tyrinėjo rRNR optines ir hidrodinamines (klampumą, sedimentaciją) savybes ir priėjo prie išvados, kad RNR turi spiralinius fragmentus, dažnai vadinamus segtukais.
Visų tRNR kamienų susidarymą lemia Votsono-Kriko tipo vandenilinės jungtys. Susidarant vandenilinėms jungtims dalyvauja ir minorinės heterociklinės bazės. tRNR antrinę struktūrą taip pat stabilizuoja sąveika tarp gretimų heterociklinių bazių plokštumų – stekingas.
1963 m. pirmą kartą buvo atrastos 5S rRNR. Pastaraisiais metais nemažai dėmesio skiriama 5S rRNR antrinės struktūros tyrimams. 5S rRNR, priklausomai nuo išskyrimo metodų, ir temperatūros, tirpalo joninės jėgos ir kt. būna natyvios (A formos) ir iš dalies denatūruotos (B formos). Šias formas galima atskirti. B formą galima iš dalies renatūruoti į A formą, kuri truputį skiriasi nuo natyvios 5S rRNR. Taigi tiriant 5S rRNR struktūrą, labai svarbu žinoti, kokia jos forma.
Neseniai buvo aptikti pagal veikimą į virusus viroidai. Jie sukelia bulvių, pomidorų, agurkų, citrinų, chrizantemų, apinių, kokoso palmių ligas. Viroidai – tai nedidelės žiedinės RNR, kurių gerai organizuota antrinė struktūra.
Tretinė RNR struktūra
Tretinė struktūra – tai makromolekulės struktūra, kuri formuojasi erdvėje įvairiai išsidėstant spiraliniams ir nespiraliniams RNR fragmentams. Ji priklauso nuo vandenilinių, joninių jungčių ir kitų jėgų, jungiančių tam tikrus nukleino rūgšties fragmentus tiek vieną su kitu, tiek su kitomis organoido, citoplazmos ar terpės molekulėmis. Tretinė struktūra tiriama BMR, IR, UV spektroskopijos, optinio sukimosi dispersijos, cirkuliarinio dichroizmo, cheminės modifikacijos, izotopų mainų metodais. Reagentai tretinei RNR struktūrai tirti yra įvairios ribonukleazės bei žymėti oligonukleotidai, komplementarūs tam tikriems RNR fragmentams.
Dar septintajame dešimtmetyje buvo nustatyta, kad tRNR turi tretinę struktūrą. Tačiau tiksliausia informacija gaunama tiriant rentgenostruktūrinės analizės metodu (RNR turi būti kristalinė). 1968 m. daugelyje labaratorijų buvo gauti tRNR kristalai, tačiau jie netiko rentgenostruktūriniams tyrimams.
tRNR molekulėje gausu vandenilines jungtis sudarančių grupių. Be jų tRNR tretinę struktūrą stabilizuoja sąveika tarp heterociklinių bazių plokštumų – stekingas. Stekinge dalyvauja ne tik tos bazės, kurios sudaro dvispiralinius fragmentus, bet ir bazes, esančios viengrandinės tRNR kilpose (nedalyvauja tik 5 iš 76 heterociklinių bazių).
Taigi vandenilinės jungtys ir stekingas sąlygoja tRNR tretinę struktūrą.
Kai kurių augalų virusų RNR 3´-gale yra fragmentas, panašus į tRNR. Šios virusinės RNR gali aminoacilintis. Paaiškėjo, kad šių virusinių RNR 3´-galinio fragmento antrinė struktūra ne dobilo lapo formos.
Tiksli sudėtingų RNR molekulių tretinė struktūra nežinoma.
Naudota literatūra
1. Nukleino rūgščių chemijos ir biochemijos pagrindai (B. Juodka)
2. Augalų fiziologija ir mikrobiologijos pagrindai (S. Borusas, P. Pranaitis, V. Šlapakauskas)
3. Biologija 11 kl. 1 dalis (Sylvija S. Mader).