Ankstyvaisiai 1950, greitai po Watson ir Crick pasiūlytos antrinės DNR struktūros, mūsų molekulinis supratimas apie paveldimų savybių perdavimą iš vienos kartos į kitą, galėjo būti apibendrintas dviem teiginiais:1. Biomolekulė, atsakinga uz genetinės informacijos saugojimą ir perdavimą, vadinama DNR.2. DNR molekulės struktūra apibūdinama kaip dviejų polideoksiribonukletodų dviguba spiralė, susidariusi suporavus komplementarias bazes.Abu šie teiginiai padarė revoliuciją biochemijoje ir genetikoje. Nauji faktai iškelė ir naujus klausimus, į kuriuos turėjo būti rasti atsakymai. DNR struktūros išaiškinimas davė stimulą vykdyti eksperimentinius projektus, kurie geriau paaiškintų, kaip vyksta genetinės informacijos perdavimas. Svarbūs klausimai, į kuriuos turėjo būti rasti atsakymai buvo:1. Koks yra DNR informacijos perdavimo iš vieno kartos ląstelių į sekančią molekulinis mechanizmas? DNR turi būti kopijuojama ir dublikatas turi buti perduotas dukterinėms ląstelėms. Kad karta būtų gyvybinga, dublikacijos procesas turi būti atkuriamas ir tikslus.2. Kaip ……………………………………… Biologinė informacija DNR kalba turi būti išversta į proteinų kalbą.Iš pirmo žvilgsnio, DNR regis yra standi stacionari, nesikeičiančios struktūros dviguba spiralė. Tačiau yra priešingai. Mažiausiai trijų antrinių sturktūrų egzistatvimas (A, B, Z) ir ekstensyvi tretinė stuktūra sufleruoja, DNR dinaminė struktūra įtakoja įvairius susijungimus. Replikacijos ir transkripcijos mentu DNR dviguba grandinė gali susisukti į supermonetas, išsivyti į atskiras vijas ir susilankstyti……………… Šie procesai turi būti tikslūs ir kontroliuojami, nes bet kokie pakitimai pirmineje DNR grandinėje bus perduodi ateities kartoms. Aisku su išimtimis, tačiau įprastai DNR molekulė yra dviguba spiralė, esanti apvalios arba pailgos formos. Mes turime palyginti užbaigtą vaizdą, kaip vyksta DNR molekulės replikacijs ir transkrikcija prokariotų ląstelėse, ypatingai Esherichia coli. Mūsų supratimas apie replikaciją eukariotų ląstelėse nėra pilnas. Todėl nagrinėdami DNR metabolizmą turėsime omeny E.coli apvalią DNR. Replikacijos ir transkripcijos principai eukariotų ląstelėse yra panašūs, tačiau daug sudėtingesni, DNR yra linijinė, t.p. veikia daug daugiau fermentų bei proteinų.
DNR replikacijos ypatumai
Jei Watson‘o ir Crick‘o hipotezė apie replikaciją yra teisinga, tuomet kiekviena DNR vija yra naudojama kaip kaip šablonas naujos vijos sintezei. Naujoji DNR, pagal pasiūlytą semiconservetive modelį, būtų hibridas. Kiekvienas naujas dupleksas susidarytų iš vienos originalios vijos ir vienos naujai susintetintos (11,1 pav.) Kitame modelyje, pavadintame conservetive model kiekviena atskira DNR vija yra replikuoujama ir naujai susintetinta vijos kombinuojamos, kad sudarytų porą. Įrodymai, pariamentys pirmąją teoriją, buvo rasti 1957-1958. Buvo auginama daug E.coli kartų terpėje, turinčioje NH4Cl su pažymėtu 15N atomu. Tokiu būdu ląstelėje sintetinosi azoto turinčios biomolekulės, o taip pat DNR, kuriose 14N buvo pakeistas 15N. 15N turinčios DNR yra sunkesnės nei DNR su 14N. Tuomet ląstelės E.coli, turinčios 15N-DNR buvo pervestos į naują terpę, turinčią 14NH4Cl. Po vienos ir dviejų ląstelės kartų (dvigubinant populiaciją kiekvieną kartą), DNR buvo izoliuota nuo ląstelių išanalizuota. Šis eksperimentas leido atsikirti, išanalizuoti ir charakterizuoti tris DNR tipus, (1) „sunkioji“ DNR, turinti dvi 15N-DNR vijas iš pirmojo bandymo; (2) „lengvoji“ DNR, turinti dvi 14N-CHR vijas; ir (3) „hibridinė“ DNR, turinti vieną viją su 14N ir vieną su 15N. Eksperimentiniai duomenys parėmė semiconservative modelį DNR replikacijai. Panašūs eksperimentai buvo pakartoti su kitomis prokariotinėmis ir eukariotinėmis ląstelėmis (įskaitant augalus) ir tai pademonstravo, kad semiconservetive modelis replikacijai yra universalus.Pirmą kartą DNR replikacijos procesas vizualiai buvo stebėtas 1950. E.coli buvo užauginta terpėje, turinčioje radioakryviai pažymėtų nukleozidą, 3H-timidiną. 3H žymėta bazė buvo įjungtas į naujai susintetintą DNR. Išskirta radioaktyvi DNR buvo ištirta. DNR buvo paskleista ant fotografinės emulsijos, kad būtų gautas fotografinis vaizdas. (11.3 pav.). Buvo stebimas išsišakojimas arba kilpos. Manoma tai buvo DNR molekulės vykstanti replikacija. Ši struktūra buvo pavadinta replication forks. Apvalioje DNR molekulėje replikacija prasiedėjo tam tikrame taške ir vyko į abi puses, tokiu būdu kopijuojant abi polinukleotidų vijas. Tolimesni eksperimentai, kurie rėmėsi anskčiau aprašytais stebėjimais, parodė, kad dvi replication forks susidarė kiekvienoje DNR molekulėje. Bendras replikacijos procesas, kaip mes suprantame jį dabar yra pavaizduotas (11.4 pav). Dviejų replication forks susidarymo pasekoje auga replikacinis burbulas. replication forks didėja į priešingą pusę ir baigiasi susitikimu kitoje apvalios DNR pusėje. Šis mechanizmas dažnai vadinamas „teta replikacijos modeliu“, nes tarpinis junginys yra panašus į graikišką raidę θ.
Eukariotinės DNR molekulės, kurios yra linijinės, replikuojaci panašiai (11.5 pav). Pagrindinis skirtumas yra tame, kad replikacija prasideda iškarto keliose vietose. To pasekoje susidaro keli replikaciniai burbulai, formuojantys dvigubų vijų DNR molekulę. Visi anksčiau aprašyti eksperimentai atskleidė pagrindiniu DNR molekulės replikacijos principus, tačiau neatskleidė informacijos apie molekulinį lygį. Klausimai, į kuriuos liko neatsakyta, buvo: kokia yra DNR sintezės kryptis (5‘→ 3‘ ar 3‘→ 5‘)? Kaip susidaro fosfodiesteriniai ryšiai tarp susiformavusių mononukleotidų?DNR polimerazė IPirmas rastas fermentas, kuris galejo katalizuoti DNR sintezę, dabar vadinamas DNR polimeraze I, buvo išskirtas iš E.coli, išgrįnintas ir ištirtas 1957m. Pagrindinė katalyzės fermentu reakcija yra tokia:
dNTP + (dNMP)n ó (dNMP)n+1 + PPi
kur dNTP = deoxyribonucleosid triphophates, dNATP, dGTP, dCTP, dTTP (dNMP) = susidariusi DNR su n ar n+1 nukleotidu PPi = pyrophosphate
Specialūs realcijos proceso reikalavimai yra Mg+2 jonai nukleotidų kompleksavimui , o taip pat iš anksto „sudaryta DNR“, kuri reikalinga dviems tikslams. (11.6 pav.) Pirma: DNR elgiasi kaip šablonas, kuris kuri neša savyje informaciją, kuri turi būti nukopijuota. Ši informacija nuskaitoma pagal bazių poravimo taisykles. Antra: DNR turi turėti primer segmentą su laisva 3‘-hidroksilo grupe. Prie šios grupės kovalentiškai prisijungia ateinantys nukleotidai. DNR polimerazė I negali pradėti naujos polinukleotidų grandinės be tokio primer. Išvertus į cheminę kalba, reakcija prasideda polinukleofiline ataka, kai laisva primer 3‘-hidroksilinė grupė atakuoja ateinantį nukleofilą, kuris yra išrinktas pagal bazių poravimo taisykles. Tokiu būdu, grandinės pailgėjimas atsiranda 3‘ gale , o DNR sintezė vyksta nuo 5‘ galo 3‘ galo kryptimi. Kadangi grandinės yra antilygiagrečios, informacija iš DNR nuskaitoma kryptimi 3‘ → 5‘. Energija, reakcijai vykti gaunama atsiipalaiduojant pirofosfato molekulei. Tai reaktingos molekulės ir jos tuoj pat yra hifrolizuojamas atsipalaiduojant energijai ir susidarant dviem ortofosfaro molekulėms Pi (PPi + H2O → 2Pi).Tolimesnės mutavusių E.coli ląstelių studijos atskleide dvi apildomas DNR polimersazes, vadinamas DNR polimeraze II ir DNR polimeraze III.
Manoma, kad primary replikacinis fermentas E.coli ląstelėse yra DNR polimerazė III. Polimerzės III polimerizacijos greitis yra didesnis, taip pat tai yra didelis kompleksas su 10 polipeptidiniai subvienetais ir molekuline mase 900000 daltonų. Tuomet kokios funkcijos yra polimerazės I ir polimerazės II? Greičiausaiai jos atlieka redagavimo funkcijas, t.y. randa ir ištaiso klaidas, kad užtikrintų tikslią DNR sintezę. Šie fermentai veikia kaip nukleazės, katalizuojančios fosfodiesterinių ryšių hidrolizę. DNR polimerazė I yra 3‘ → 5‘ egzonukleazė. Ji viekia kaip hidrolizuojantis fermentas.