Klonavimas

Išsamus straipsnis apie klonavimà.

Galimas klonavimo panaudojimas:
1) Organø, reikalingø persodinimui, klonavimas iš kamieniniø làsteliø.
2) Klonuoti graþius + sveikus þmones.
3) Moksliniams tyrimams.
4) Kt.

Pirmas þinduolis buvo klonuotas Roslin Institute (Edinburgas, Škotija) grupës mokslininkø, vadovaujamø Ian Wilmut (paskelbta 1997.2.). Tai buvo avis Dolly, klonuota iš tešmens làstelës (dël to vardas parinktas pagal JAV daininkæ Dolly Parton). Tai buvo svarbus ávykis, áþiebæs visuotiná susidomëjimà klonavimu ir árodæs, kad suaugusiø þinduoliø klonavimas ámanomas. Iki tol buvo neþinoma, ar suaugæs branduolys vis dar gali produkuoti naujà gyvûnà, ar neetrukdys genetiniai paþeidimai ir genø deaktyvacija.

Bet uþ Roslin texnikà efektyvesnë ir geriau išvystyta yra Honolulu texnika. 1998.7 Havajø un-to mokslininkai Teruhiko Wakayama ir Ryuzo Yanagimachi klonavo 3 peliø kartas. O kai paaiškëjo, kad Honolulu texnika efektyvi, Wakayama klonavo paèius klonus, tuo árodydamas, kad jie turi pilnavertes reprodukcines funkcijas.

Dar viena su klonavimu susijusi texnika yra dvyninimas [twinning]. Kai natûraliai apvaisintoje kiaušialàstëje prasideda dalijimasis, 8 làsteliø embrionà galima suskaldyti ir ásodinti á 8 gimdas. Gims 8 klonai. Bet tai ne suaugusio þinduolio klonavimas.

Beje, kiekviena tyrinëtojø grrupë turi savo specifinæ klonavimo texnikà.

2001.11.25. Buvo paskelbta, kad pirmàkart klonuotas þmogaus embrionas.

KLONAVIMO PROCEDÛROS
ROSLIN TEXNIKA HONOLULU TEXNIKA
REIKALINGOS PRIEMONËS
LÀSTELËS:
• Somatinës donorinës làstelës; vieno audinio tipo làstelës, paimtos iš norimo klonuoti individo. (Pvz. avis Dolly buvo klonuota iš tešmens làstelës).
• Neapvaisintos ki

iaušialàstës, paimtos iš patelës.
TERPËS:
• Donoriniø làsteliø augimo terpë, kurioje jos augs ir dalinsis (kad prisiauginti pakankamà jø kieká).
• Skurdþioji terpë, skirta donorinëms làstelëms minimaliai egzistuoti, kai jos nustoja dalintis ir áeina á ramybës stadijà. [minimal tissue culture media], [petri dishes].
• Natûralus kiauštakis ar dirbtinë kiaušialàsèiø augimo terpë, kurioje dirbtiniu implantavimu apvaisintos kiaušialàstës augs ir dalinsis 6 dienas (avies atveju).
LABORATORINËS PRIEMONËS:
• Inkubatorius, sterilus gaubtas, mikroskopai, árankiai làstelës branduolio pašalinimui (tame tarpe mikrošvirkštelis su adata skaidriu galu), mikro elektostimuliacijos aparatas ir kt. LÀSTELËS:
• Somatinës donorinës làstelës, paimtos iš norimo klonuoti individo. Jeigu tai ne reprodukcinës, odos, kraujo ir kaulø smegenø làstelës, jas reikia paveikti telomeraze, kad neimtø senti anksèiau laiko (þr. biologinis laikrodis, telomerø sutrumpëjimas). Geriausia prigyja {cumulus} làstelës (jas turi tik paatelës). Maþiau tinka {sertoli} (jas turi tik vyrai) ir smegenø làstelës.
* {Cumulus} – làstelë apgaubianti kiaušialàstæ prieš ovuliacijà.
* {Sertoli} – làstelë gaubianti spermatozoidà.
• Neapvaisintos kiaušialàstës, paimtos iš patelës.
TERPËS:
• Cytochalasin B.
LABORATORINËS PRIEMONËS:
• Mikroskopai, árankiai làstelës branduolio pašalinimui ir implantavimui á kiaušialàstæ (tame tarpe mikrošvirkštelis su adata skaidriu galu) ir kt.
DONORINËS SOMATINËS LÀSTELËS.
Paimkite iš klonuojamo individo vienà ar daugiau làsteliø; bet jos turi bûti to paties audinio tipo (pvz. avis Dolly klonuota iš tešmens làstelës); jos turi bûti somatinës (þmoguje – 46 xromosomos), o
ne lytinës (þmoguje – 23 xromosomos). Prisiauginkite mëgintuvëlyje pakankamà donoriniø làsteliø kieká. Jeigu tai ne reprodukcinës, odos, kraujo ir kaulø smegenø làstelës, jas reikia paveikti telomeraze, kad neimtø senti anksèiau laiko (þr. biologinis laikrodis, telomerø sutrumpëjimas).

Honolulu texnika: imamos tos làsteliø rûšys, kuriø natûrali bûsena yra {Gap Zero arba G0}. Taigi T.Wakayama pasielgë praktiškiau negu I.Wilmut – jis tiesiog paëmë klonavimui tas làsteliø rûšis, kuriø ciklo net nereikia sinxronizuoti su kiaušialàste. Jis naudojo tris làsteliø tipus: 1) {Sertoli}, 2) smegenø, ir 3) {Cumulus}. {Sertoli} ir smegenø làstelës bûna {G0} stadijoje visada, o {cumulus} làstelës yra beveik visada arba {G0} arba {G1} stadijoje. {Cumulus} geriausiai prigyja.
* {Cumulus} – làstelë apgaubianti kiaušialàstæ prieš ovuliacijà.
* {Sertoli} – làstelë gaubianti spermatozoidà.
SINXRONIZACIJA: MIEGO STADIJA {G0} SUKELIAMA SKURDÞIOJE TERPËJE (tik Roslin texnikoje).
Roslin texnika: Perkelkite donorines làsteles á specialià skurdþià terpæ. To mišinio turi vos pakakti jø gyvybës palaikymui. Badaujanèios làstelës išjungia aktyvius genus, nustoja dalintis ir áeina á miego stadijà {Gap Zero} (arba {G0}), kurios metu apmiršta. Be ciklø sinxronizacijos kiaušialàstë donorinio branduolio nepriima (nugaišta).
Šá metodà, kaip sinxronizuoti donorinës làstelës ir kiaušialàstës ciklus, atrado Ian Wilmut ir Keith Cambell.
KIAUŠIALÀSTËS IŠBRANDUOLINIMAS.
Tuo metu, kai kultûrintos donorinës làstelës jau yra ramybës stadijoje paimkite neapvaisintà kiaušialàstæ ir pašalinkite iš jos branduolá, pvz. išsiurbdami mikrošvirkšteliu ir tà br

randuolá išmeskite (Roslin texnika; nes Honolulu texnikoje klonavimui imamos tik tos làstelës, kurios beveik visada yra reikalingoje {G0} stadijoje). Stenkitës kiaušialàstæ kuo maþiau paþeisti.

DONORINËS LÀSTELËS BRANDUOLIO IŠËMIMAS (tik Honolulu texnikoje).

Honolulu texnika. Branduolys iš donorinës làstelës išsiurbiamas mikrošvirkšteliu. (Pelës klonavimo atveju – per kelias minutes po làstelës paëmimo iš pelës.).
IŠBRANDUOLINTOS KIAUŠIALÀSTËS IR SOMATINËS LÀSTELËS (AR TIK JOS BRANDUOLIO) SUJUNGIMAS.
Roslin texnika. Paimkite ramybës stadijoje esanèià donorinæ làstelæ ir ákiškite jà “cielà” pro kiaušialàstës apvalkalo plyšá, – á {zona pellucida} prie kiaušinëlio arba padëkite priglaudæ prie kiaušialàstës. Honolulu texnika.
Á išbranduolintà kiaušialàstæ su mikrošvirkšteliu transplantuokite donorinës somatinës làstelës branduolá.
Skirtingai nei Roslin texnikoje èia buvo išvengta mëgintuvëlio ar kitø dirbtiniø terpiø, kultûrinimas atliktas làstelëje. Po 1-6 val. po transplantacijos ávyksta xromosomø kondensacija.
STIMULIAVIMAS.
Roslin texnika: kiaušialàstës elektrostimuliacija. (Dël jos elektros srovës stiprumo ir trukmës vadovaukitës avies klonavimo procedûros aprašymu. Jis buvo pradëtas po 1-8 valandø). Elektriniu dirginimu imituojama aktyvacija, kurià natûraliai sukeltø spermatozoidas. Tai sukelia làsteliø susiliejimà, kurá galite stebëti per mikroskopà. Tuo paèiu suaktyvinamas embriono vystymàsis.
Manoma, kad genetinë programa pradedama realizuoti, kai donorinës làstelës {protien} signalai pakeièiami kiaušialàstës {protien} signalais. Elektrostimuliacija padeda perduoti tuos {protien} signalus pro branduolio membranà. {Electroporation} yra áprasta texnika DNR molekuliø ávarymui pro làstelës membranà. Deja maþai elektriškai aktyvuotø làsteliø iš
šgyvena ir išauga á embrionà. Honolulu texnika: kiaušialàstës xeminë stimuliacija. Praëjus valandai po transplantacijos kiaušialàstë naujà branduolá ásisavina, o dar po 5 valandø kiaušialàstæ ádëkite á xeminæ terpæ, kad prasidëtø làstelës augimo šuolinis startas [jumpstart], kurá gamtoje inicijuoja apvaisinimas. Naudojama xeminë substancija yra cytochalasin B. Ji neleidþia formuotis poliariniam kûnui (arba porinei làstelei), kuris paprastai susiformuoja dar prieš apvaisinimà ir paima iš làstelës pusæ genø (þmoguje – 23 xromosomas), paruošdamas jà priimti genus iš spermatozoido.
KLONØ SKAIÈIAUS GAUSINIMAS.
Bûtinai pakartokite praeitas procedûras daug kartø, kad gautumëte pakankamai klonø. Þinokit, kad dël làstelës paþeidimø ir kitø þalingø faktoriø, daugelis bandiniø þus. Jei viskas padaroma teisingai, vienas iš keliø šimtø bandymø turëtø pavykti ir gims normalus donorinio gyvûno replikatas (kopija).
Roslin texnika. I.Wilmut klonuojant avá, sëkmës santykis buvo 1 iš 277. Honolulu texnika. T.Wakayama’i su pelëmis pasisekë labiau: 3 iš 100.
EMBRIONO AUGINIMAS DIRBTINËJ ARBA NATÛRALIOJ TERPËJ.
Išlikusiam gyvam embrionui sudarykite sàlygas augti ir kelis kartus pasidalinti natûraliam kiauštakyje [oviduct] arba pakankamai panašioj terpëje.
Roslin texnika. Bandymams pasirinkta avis patogumo dëlei. Jos kiaušinëlis prieš pradëdamas dalytis laukia kelias valandas – galbût kiaušinëliui reikia laiko persiprogramuoti naujà branduolá.
Vienas iš nedaugelio išgyvenæs embrionas maþdaug 6 paras augo inkubuotas á avies kiauštaká [oviduct]. Ir aišku, þymiai daþniau išgyvena làstelës, ankstyvoje savo vystymosi stadijoj ádedamos á kiauštakius, negu inkubuotos laboratoriškai. Honolulu texnika. Po minëto šuolinio starto làstelë dalijasi ir vystosi á embrionà, kurá galima transplantuoti á surogatinæ motinà iki gimdymo. Geriausiai procesà ištvërë {cumulus} làstelës, todël tyrimai buvo sukoncentruoti á šio tipo làsteles.
Iki tol pelës buvo laikytos vienu iš sunkiausiai klonuojamø þinduoliø, nes beveik iškart po pelës kiaušialàstës apvaisinimo prasideda dalijimasis. Netgi ir be šios “prabangos” T.Wakayama ir R.Yanagimachi sugebëjo klonuoti, ir net su daug aukštesniu pasisekimo laipsniu (3 iš 100) negu I.Wilmut (1 iš 277).
IMPLANTAVIMAS Á GIMDÀ.
Implantuokite embrionà á patelës gimdà. Avies atveju tai buvo padaryta po to, kai embrionas 6 paras paaugo avies kiauštakyje [oviduct]. Jeigu nieko blogo neatsitiks, jis bus normaliai išnešiotas ir pagimdytas. Bet kaip ir identiškø dvyniø atveju tai nebus tiksli donorinio individo kopija.

Leave a Comment