Rekombinantinio interferono-β gamyba ir terapinis pritaikymas

2375 0

Referatas

Rekombinantinio interferono-β gamyba ir terapinis pritaikymas

Turinys

1. Įvadas 2

2. Interferonas beta 3

2.1. Interferonų tipai 3

2.2. I tipo interferonų funkcijos 3

2.3. Interferono-β panaudojimas 3

3. Interferono sintezė 4

3.1. Rekombinantinis interferonas-β 4

3.2. Rekombinantinio interferono-β sintezė 4

3.3. Rekombinantinio IFN-β sintezės tobulinimo tyrimai 5

3.3.1. Glikozilinimo įtaka IFN-β-1a aktyvumui 5

3.3.2. IFN-β-1b sekrecijos į periplazminę ertmę pritaikymas sintezėje 6

4. Interferono beta terapinis pritaikymas 10

4.1. Išsėtinė sklerozė 10

4.1.1. Ligos apibūdinimas 10

4.1.2. IFN-β veikimo mechanizmai 10

4.2. Reumatoidinis artritas 12

4.2.1. Ligos apibūdinimas 12

4.2.2. IFN-β poveikis esant RA (pelėms) 12

4.2.3. IFN-β poveikis esant RA (rezus beždžionėms) 13

4.3. Šalutiniai poveikiai 14

4.4. Interferono-β preparatai 15

4.4.1. Avonex 15

4.4.2. Rebif 15

4.4.3. Betaseron/Betaferon 16

5. Išvados 17

6. Informacijos šaltiniai 18

1. J. van Holten, C. Plater-Zyberk, PP Taak: Interferon-beta for treatment of rheumatoid arthritis. Arthritis Res (2002) 4:346-352. 18

1. Įvadas

Interferonai-β, tai svarbūs žmogaus organizmui baltymai, atliekantys įvairias funkcijas organizme. Jie natūraliai randami organizme, taip pat genų inžinerijos metodais yra sintetinami jų preparatai.

Medicininiais tikslais yra kuriamos įvairios interferono-β formos, kurios skiriasi savo biologinėmis savybėmis, aktyvumu. Jų veikimą ir aktyvumą lemia sintezės metodai, naudojamos ląstelės, medžiagos, vektoriai. Šiame darbe bus apžvelgti keli interferono-β gamybos būdai, bei tyrimai atliekami norint pagerinti preparatų savybes.

Genų inžinerijos metodais kuriamos interferono-β formos yra plačiai naudojamos medicinoje ligų gyydymui ar kontroliavimui. Darbe bus aprašytas interferono-β terapinis veikimas, bei prekyboje esantys jo preparatai.

2. Interferonas beta 2.1. Interferonų tipai

Interferonai – tai natūraliai sintetinamų baltymų šeima, pasižyminti ryškiomis imuninių mediatorių funkcijomis. [1] Jie skirstomi į dvi grupes, tai I tipo interferonai (IFN-α ir IFN-β) ir II

I tipo interferonai (IFN-γ). [2,3] Šios dvi interferonų grupės atlieka priešingas funkcijas, IFN-γ skatina uždegiminius procesus, o IFN-β pasižymi priešuždegiminėmis savybėmis [4]. IFN-α baltymų grupę sudaro apie 20 struktūriškai panašių polipeptidų, kuriuos sintetina daugiausiai mononukleariniai fagocitai ir todėl kartais jie vadinami leukocitų interferonu. IFN-β yra baltymas, kurį sintetina fibroblastai, epitelinės ir kitos ląstelės. IFN-β, dar vadinamas fibroblastų interferonu, yra sudarytas iš 166 amino rūgščių, jį koduojančiame gene nėra intronų ar aprašytų polimorfizmo atvejų. [5 p. 152,6,7]

2.2. I tipo interferonų funkcijos

I tipo IFN apsaugo organizmą nuo virusų ir aktyvina ląstelinį imunitetą, jie slopina virusų replikaciją skatindami ląsteles sintetinti įvairius fermentus, kurie slopina viruso RNR ir DNR transkripciją bei viruso replikaciją, šio tipo interferonai skatina I klasės HLA (angl. human leukocyte antigen – žmogaus leukocitų antigenų) moolekulių ekspresiją, kadangi CD8+ T citotoksiniai limfocitai atpažįsta svetimą antigeną, prisijungusį prie I klasės HLA molekulių. I tipo interferonai aktyvina I klasės HLA molekulių, asocijuotų su virusų antigenais infekuotų ląstelių paviršiuje, atpažinimą ir jų suardymą citotoksiniais T limfocitais. [5, p.152] IFN-β slopina uždegimo mediatorius (citokinus): interleukiną-1 (IL-1β) ir navikų nekrozės faktorių (TNF-α), taip pat skatina interleukino-10 (IL-10) bei IL-1 receptorių antagonistų sintezę [8], slopina T ląstelių proliferaciją ir migraciją, užkerta kelią nuo kontakto priklausančiai T ląstelių monocitų aktyvacijai [9]. Taip pa

at atrasta, jog IFN-β skatina transformuojančio augimo faktoriaus (TGF-β1), ir šio faktoriaus antro tipo receptoriaus (TGF-β-R-II), genų ekspresiją mononuklearinėse periferinio kraujo ląstelėse. [10]

2.3. Interferono-β panaudojimas

Dėl savo savybių, interferonas-β vis dažniau naudojamas medicinoje, kaip potencialiai aktyvus vaistas imuninėms ligoms gydyti. Interferono-β terapija mažina išsėtinės sklerozės paūmėjimų skaičių. [11] Manoma, jog IFN-β turi priešuždegiminį poveikį esant artritui, nes pastebėta, jog esant dideliam IFN-β kiekiui kraujo serume, sumažėja ankstyvaus chroninio artrito sukeliamas sąnarių skausmas. [12,13] Taip pat tiriamas IFN-β poveikis esant infekcinėms ligoms [14], išorinių lytinių organų karpoms [15], piktybinei melanomai [16] ar kitoms onkologinėms būklėms [17].

3. Interferono sintezė 3.1. Rekombinantinis interferonas-β

Yra du rekombinantinio žmogaus interferono-β tipai. (1 pav.) Pirmas, rhIFN-β-1a yra glikozilintos formos, jis yra sintetinamas žinduolių ląstelėse, dažniausiai Kinų žiurkėno kiaušidžių (CHO – Chinese Hamster Ovary) ląstelėse. Šio tipo rIFN-β amino rūgščių seka yra identiška žmogaus interferono-β aminorūgščių sekai. [18] Antro tipo, rhIFN-β-1b, yra sintetinamas Escherichia coli bakterijose, jis nėra glikozilintas [19], be to jame yra ne 166, o 156 amino rūgštys ir 17-oji yra ne cisteino, o serino amino rūgštis (Cys→Ser). [20] Terapinis rhIFN-β-1a pavadinimas yra Avonex arba Rebif, o rhIFN-β-1b – Betaseron. [19]

1 pav. Abiejų interferono-β tipų struktūra. Kairėje – rhIFN-β-1a, kuris yra glikozilintos formos, dešinėje – IFN-β-1b, kuriame cisteino amino rūgštis yra pakeista į serino aminorūgštį.

3.2. Rekombinantinio interferono-β sintezė

Didžioji dalis rekombinantinių bal

ltymų yra sintetinami rekombinantinės DNR technologijos būdu gram neigiamose Escherichia coli bakterijose, nes jos geba greitai augti tankiose terpėse, yra nuodugniai ištirta jų genetika ir fiziologija bei joms galima pritaikyti daugumą biotechnologijų, daugumą klonavimo vektorių. [21,22] Escherichia coli geba sekretuoti baltymus į periplazminį tarpą (tarpmembraninę ertmę), tai pranašumas lyginant su baltymų sinteze ląstelės viduje, nes išvengiama intarpinių kūnelių susidarymo. Tai supaprastina nuoseklų sintezės procesą, baltymų stabilumą, gryninimą ir N-galo apdorojimą, taip pat sumažina baltymo degradaciją, be to, periplazmos aerobinė aplinka lemia tikslų potransliacinį baltymų susisukimą. [23] Žmogaus interferonas-β pagamintas E. coli yra toksiškas pačiai bakterijai, bet šio rekombinantinio baltymo susikaupimas periplazmoje sumažina jo mirtiną poveikį ląstelei. [24]

Norint sukurti geresnių savybių interferono-β prepartatus, vykdomas jų glikozilinimas. Baltymo glikozilinimas nereikalauja papildomos manipuliacijos sintezės metu, nes tai yra natūralus baltymų modifikacijos procesas vykstantis žinduolių ląstelėse. Yra žinoma, jog glikozilinimas yra svarbus rhIFN-β aktyvumui. [19,25] rhIFN-β-1a, kuris yra glikozilintos formos, pasižymi didesniu specifišku aktyvumu ir imunogeniškumu, nei rhIFN-β-1b [19]. Tyrimai parodė, jog šį žymų skirtumą lemia glikozilinimas, nes polisacharido fragmentas nulemia baltymo stabilumą, tirpumą ir biologinį aktyvumą. Todėl glikozilinimas gali būti puikus metodas gerinti biofizines glikoproteinų savybes, tokias kaip jų struktūros stabilumas ar farmakokinetika [26].

3.3. Rekombinantinio IFN-β sintezės tobulinimo tyrimai

Atliekami tyrimai, norint nepažeidžiant rhIFN-β aktyvumo, pagerinti jo biologines sav

vybes, tokias kaip agregacija, produktyvumas, stabilumas ir farmakokinetinis aktyvumas.

3.3.1. Glikozilinimo įtaka IFN-β-1a aktyvumui

Kyoung Song su kolegomis atliko tyrimą [27], kurio metu, atliekant žinomos vietos mutaciją, buvo kuriama rhIFN-β forma su papildomu glikozilinimu. Ši forma buvo pavadinta R27T ir apibrėžta kaip rhIFN-β-1a su mutacija 27 vietoje (Thr pakeista į Arg) ir su dvejomis N-glikozilintomis sritimis: prie 80-os (originali vieta) amino rūgšties ir prie 25-os amino rūgšties (papildoma vieta). Šis glikozilinimas neturėjo įtakos baltymo jungimuisi su ligandu, taip pat nebuvo užfiksuota jokio specifinio aktyvumo. R27T baltymas buvo stabilesnis ir mažiau linkęs į agregaciją, taip pat turėjo ilgesnį gyvavimo pusperiodį. [27]

 

2 pav. – rhIFN-β baltymo schema. Stačiakampiai (A, B, C, D, E) nurodo penkių α-kilpų vietas. Kiekviena vertikali linija nurodo potencialias N-galo glikozilinimo vietas, įvykęs oligosacharido prijungimas – R27 ir N80 vietose. [27]

Kyoung Song eksperimento metu glikozilinti analogai buvo sukurti PGR metodu, atliekant žinomos vietos mutaciją, naudojant natūralų IFN-β. Viso ilgio genas buvo atkurtas ir klonuotas į pMSG genų ekspresijos vektorių. Stabilus geno įterpimas į CHO ląsteles buvo atliktas naudojant dihidrofolato reduktazės atrankos sistemą, metotreksatui atsparūs klonai buvo užauginti metotreksatu žymėtoje terpėje. rhIFN-β-1a ir rhIFN-β mutuoti baltymai (R27T) buvo išgryninti aukšto slėgio chromatografijos (HPLC) ir gel-elektroforezės metodais. Gauti produktai buvo nustatomi SDS-PAGE ir western blotting metodais naudojant Anti- rhIFN-β antikūnus. [27]

Sukurto baltymo antivirusinės savybės buvo įvertintos nustatant R27T skirtingų koncentracijų gebėjimą apsaugoti A549 (žmogaus plaučių vėžio ląstelės) ląsteles nuo viruso sukelto citopatinio poveikio. Kaip standartas naudotas natūralus rhIFN-β. Nustatyta, jog glikozilinimas nesusilpnino antivirusinio poveikio. [27]

Įvertinus rhIFN-β-1a ir R27T dispersiškumo laipsnius, nustatyta, jog rhIFN-β-1a du kartus dispersiškesnis, kas gali lemti rhIFN-β1a nestabilumą vendeninėje aplinkoje, lyginant su R27T. Įvertinti antrinės struktūros stabilumą buvo taikoma ATR-FTIR (visiško vidinio atspindžio Furje transformacinė infraraudonųjų spindulių) spektroskopija, buvo apskaičiuotas α-kilpų, β-klosčių, β-linkių ir įvairių spiralių santykis tarp rhIFN-β-1a ir R27T. R27T struktūroje buvo daugiau α-kilpų ir mažiau β-klosčių, nei rhIFN-β-1a struktūroje, kas gali turėti įtakos rhIFN-β-1a agregacijai, nes anksčiau atliktos studijos parodė, jog didelis β-klosčių kiekis struktūroje didina agregacijos tikimybę. [28-30]

R27T/IFNAR2 komplekso molekulinis modelis parodė, jog 80 amino rūgšties glikozilinimas neturi įtakos baltymo ir receptoriaus sąveikai dėl didelio atstumo tarp oligosacharido ir receptoriaus, o 25 amino rūgšties glikozilinimas stabilizavo ryšį su receptoriumi, nes susiformavo naujas vandenilinis ryšys tarp R27T oligosacharido motyvo ir receptoriaus Thr44 bei Asp51 amino rūgščių. Be to, vandenilinis ryšys tarp R27T Arg35 amino rūgšties ir oligosacharido motyvo prisidėjo prie bendro R27T stabilumo. [27]

Taigi, tyrimo metu sukurta interferono-β-1a versija su papildoma glikozilinta sritimi pasižymėjo geresnėmis savybėmis, mažesne agregacijos tikimybe, didesniu stabilumu bei tvirtesniu susijungimu su IFN-β receptoriumi. 25 amino rūgšties glikozilinimas neturėjo įtakos priešvirusiniam, antiproliferaciniam ar imunomoduliaciniam poveikiui. [27]

3.3.2. IFN-β-1b sekrecijos į periplazminę ertmę pritaikymas sintezėje

Morowvat tyrimuose [24], buvo kuriamas rhIFN-β-1b ekspresijos vektorius, kuris nukreiptų baltymo sekreciją į periplazminę ertmę ir lemtų stipresnę nei įprastai betą interferoną koduojančių genų ekspresiją. [24]

IFN-β-1b ekpresijos vektorius buvo kuriamas naudojant pET25b(+) raiškos sistemą su T7 promotoriumi. Rekombinantinis žmogaus beta interferonas (rhIFN-β) buvo stipriau nei įprastai ekspresuotas kaip N-tirpus pelB sintetinis baltymas ir sekretuotas į Escherichia coli BL21 (DE3) raiškos kamieną. Izopropol-β-D-tiogalaktopiranozidas (IPTG) buvo naudojamas kaip cheminis induktorius rhIFN-β gamyboje. [24]

Beta interferono ekspresija buvo kontroliuojama T7 promotoriumi, rhIFN-β baltymas iš Escherichia coli periplazmos buvo išskirtas osmosinio šoko metodu, o atsitiktinai parinktuose transformantuose betą interferoną koduojančių genų ekpresija buvo nustatoma Western blotting metodu. [24]

Cys17 buvo pakeista serino amino rūgštimi (Cys→Ser], tai padėjo išvengti vidumolekulinių disulfidinių tiltelių ir multimerų susiformavimo. Sukurtoje plazmidėje nebuvo pasikartojančių sekų, priešlaikinių poli A uodegos sekų, CpG salų bei Chi sričių (3 pav.), kas užtikrino efektyvią rhIFN-β ekspresiją. mRNR antrinės struktūros analizė buvo atlikta norint nustatyti potencialiai nestabilius motyvus bei daug AU turinčias sritis, kurios apsprendžia mRNR stabilumą. [24]

pET-25b(+) plazmidė buvo naudojama kaip šablonas kuriant rhIFN-β į Escherichia coli periplazmą nukreipiančius vektorius.

3 pav. – schematinė sukurtos plazmidės seka. Jos struktūra: T7 promotorius, Lac operonas, N-galo pelB signalinė seka, klonavimo sritys, rhIFN-β baltymą koduojanti seka ir T7 terminatorius. [24]http://2008.igem.org/wiki/images/thumb/5/5e/Export.jpg/500px-Export.jpg

N-galo pelB signalinė seka po transliacijos nukreipia nesulankstytą baltymą į periplazminę ertmę per Sec sekrecijos mechanizmą. (4 pav.)

Signalinė seka yra nukerpama ir rekombinantinis baltymas sulankstomas dalyvaujant šaperonams ir disulfidinių jungčių izomerazėms. [31] (4 pav.)→

Po išskyrimo, rekombinantinė plazmidė buvo nustatyma elektroforezės metu. Matuojant optinį tankį prie 600nm bangos ilgio, buvo lyginama sukurto rhIFN-β ir natūralaus tipo interferono-β ekspresija (5 pav.). Nustatyta, jog natūralaus tipo interferoną ekspresuojančios ląstelės eksponentinę fazę pasiekė greičiau, nei rekombinantinio tipo interferoną-β ekspresuojančios ląstelės. Nustatyta, jog natūralaus tipo ląstelių augimas buvo greitesnis. [24]

5 pav. – Natūralaus tipo IFN-β (Wild type strain) ir sukurto rhIFN-β (recombinant strain) optinio tankio kitimas laikui einant.

Norint įvertinti IPTG poveikį rhIFN-β ekspresijai, buvo atliekama SDS-poliakrilamido gel elektroforezė (6 pav.).

6 pav. – SDS-PAGE rezultatai.

2 juosta – rhIFN-β teigiama kontrolė (Ziferonas), 3 juosta – rhIFN-β teigiama kontrolė (Betaseronas), 4 juosta – ląstelių lizatai prieš IPTG įdėjimą, 5-8 juostos – ląstelių lizatai praėjus 1, 2, 3 ir 4 valandoms po IPTG pridėjimo. Atitinkamos juostos prie 18 kDa po IPTG pridėjimo parodo, jog tai susintetintas rhIFN-β. [24]

Išskirti iš periplazminės ertmės baltymai buvo nustatomi Dot blot ir Western blotting metodais. Šie atlikti metodai patvirtino sėkmingą baltymo sekreciją į periplazminę ertmę. Densidometrinė SDS-PAGE analizė parodė, jog rhIFN-β sudarė 35% bendro ląstelės baltymo, kas šiuo atveju laikoma tinkama ir produktyvia išeiga, žinant jog periplazminis tarpas sudaro daugiausiai 40% ląstelės tūrio. [24] Ghane atliktuose tyrimuose naudojant sintetinį geną T7 promotoriaus-RNR polimerazės sistemoje buvo pasiekta 28% rhIFN-β išeiga [32], Krishna Rao ištobulino procesą iki 34% išeigos. [33]

Taigi, šiame tyrime gauta išeiga buvo didžiausia iki šiol gauta , taip pat tyrimas įrodė, jog rhIFN-β sekrecija į periplazminį tarpą yra naudingas ir efektyvus būdas išvengti neigiamo baltymo poveikio ląstelei sintezės metu. Šis produktyvus ir ekonomiškai palankus metodas gali būti pritaikomas kitų terapinių baltymų ekspresijai Escherichia coli ląstelėse. [24]

 

4. Interferono beta terapinis pritaikymas 4.1. Išsėtinė sklerozė 4.1.1. Ligos apibūdinimas

Išsėtinė sklerozė (IS) – tai demielinizuojanti uždegiminė centrinės nervų sistemos liga, pasireiškianti recidyvuojančiais ar nuolat progresuojančiais neurologinės disfunkcijos simptomais, sukeliančiais negalią [34]. Manoma, jog šios ligos metu kraujyje cirkuliuoja aktyvios T-ląstelės, kurios pereina hematoencefalinį barjerą ir patenka į centrinės nervų sistemos parenchimą. Šis T-ląstelių perėjimas į smegenis yra valdomas adhezijos molekulių, kurios dalinai yra reguliuojamos citokinų. Patekusios į smegenis, T-ląstelės sukelia uždegiminę reakciją, B ir T ląstelių susitelkimą ir makrofagų aktyvaciją, kas sukelia mielino irimą. [35]

IFN-β-1b citokino naudingas poveikis įvairaus pobūdžio išsėtinei sklerozei aprašytas daugelyje tyrimų [36, 37]. Dėl savo savybių, I tipo interferonai (IFN-β) yra plačiai naudojami pasikartojančios išsėtinės sklerozės pirminiam gydymui, sumažina ligos paūmėjimus ir uždegiminius smegenų pažeidimus. [38,39]

4.1.2. IFN-β veikimo mechanizmai

Mechanizmai, kuriais IFN-β veikia išsėtinės sklerozės procese, nėra pilnai išaiškinti, todėl atliekama daugybė tyrimų norint juos aprašyti. L.M. Ossege tyrimuose [10] norint išsiaiškinti imunomoduliacinius IFN-β-1b mechanizmus, buvo stebima TGFβ-1, TNFα ir jų receptorių TGFβ-R-II, TNFα-R-I mRNR ekspresija pacientų, sergančių recidyvuojančia-remituojančia išsėtine skleroze ir vartojančių IFN-β, kraujo serume. [10]

TGFβ-1 (transformuojantis augimo faktorius), tai daug funkcijų atliekantis citokinas, dalyvaujantis uždegimo procesuose. Jis slopina B ir T limfocitų proliferaciją, imunoglobulinų sekreciją ir interleukinų bei interferono gama ekspresiją. TGFβ-1 veikia jungdamasis prie specifinių receptorių, kurie yra daugelio ląstelių paviršiuje. Pagrindinis receptorius – TGFβ-R-II [40].

L.M. Ossege eksperimente pacientų kraujo serume, vartojančių IFN-β preparatus, buvo stebimas TGFβ-1-mRNR ir TGFβ-R-II ekspresijos padidėjimas. Taip pat in vitro atlikti tyrimai parodė, jog šie pokyčiai priklauso nuo preparato dozės. Taigi, galima teigti, jog interferono β sukelta išaugusi TGFβ-1-mRNR ekspresija lemia TGFβ-1 baltymo sintezę ir sekreciją. Išaugusi TGFβ-1 sintezė, kurią sukėlė IFN-β, taip pat buvo stebima EAE (eksperimentinio alerginio encefalomielito) gyvūnų modeliuose [41]. Atsižvelgiant į žinomas priešuždegimines ir imunosupresines TGFβ-1 savybes, manoma, jog padidėjusi TGFβ-1-mRNR ekspresija tikriausiai yra vienas iš IFN-β-1b mechanizmų, kuriais pasireiškia jo teigiamas efektas išsėtinės sklerozės gydyme. [10]

TNFα (navikų (angl. tumor) nekrozės faktorius) yra pagrindinis uždegiminio atsako mediatorius, sukeliantis daugelį sisteminių komplikacijų infekcinio proceso metu. TNFα vadinamas kacheksinu, norint jį atskirti nuo TNFβ arba limfotoksino. TNFα per endotelio ląsteles skatina adhezijos molekulių ekspresiją, kurios sąlygoja neutrofilų ir monocitų prilipimą prie jų bei tolesnę jų emigraciją. TNFα skatina kai kurių citokinų (IL-1 ir IL-6) sekreciją. Be uždegimą skatinančio poveikio, TNFα sukelia kai kurių ląstelių apoptozę. Jis jungiasi prie dviejų tipų specifinių receptorių: 55kDa TNFα-R-I ir 15 kDa TNFα-R-II. TNFα prisijungęs prie pirmo tipo aktyvina kaspazes ir sukelia apoptozę, o prisijungęs prie antro tipo receptorių, aktyvina transkripcijos faktorių (NF-κB), kas lemia priešuždegiminį poveikį. [42, 5 p.149-150]

Atlikto eksperimento duomenys parodė, jog pacientų, vartojančių IFN-β preparatą, periferinio kraujo ląstelėse stipriai bei tolydžiai mažėjo TNFα-mRNR, in vitro tyrimas įrodė, jog tai nuo dozės priklausantis efektas. IFN-β sukeliamas TNFα-mRNR mažėjimas taip pat gali būti mechanizmas, kuriuo ligos eigoje veikia interferonas β. [10]

4.2. Reumatoidinis artritas 4.2.1. Ligos apibūdinimas

Reumatoidinis artritas (RA) – lėtinė, sisteminė, autoimuninė liga, pasireiškianti progresuojančiu sąnarių uždegimu ir minkštųjų audinių pažeidimu. Pagrindiniai RA klinikiniai požymiai yra sąnarių patinimas, skausmas, sustingimas, raumenų atrofija, sąnarių deformacija. Dažniausiai deformuojasi riešo sąnariai, smulkieji pirštų sąnariai. [43]

Žinant bendrąjį IFN-β poveikį, esant reumatoidiniam artritui, gali būti taikomas gydymas rIFN-β. Taip pat atliekami tyrimai, norint išsiaiškinti IFN-β veikimo mechanizmus.

4.2.2. IFN-β poveikis esant RA (pelėms)

J. van Holten tyrimuose [44] DBA/1 pelėms, naudojant Freud adjuvantą, buvo sukeltas reumatoidinis artritas ir pastebėjus pirmuosius klinikinius ligos požymius, 7 dienas leidžiamas rekombinantinis interferonas-β. Ligos eiga buvo stebima vertinant vizualius pokyčius ir matuojant letenų prakaitavimą. [44]

Kadangi žinoma, jog citokinų genų ekspresiją reguliuoja transkripcijos faktorius NF-κB, buvo stebimas IFN-β poveikis NF-κB, tiriant citokinų ekspresiją uždegimo srityje. Nustatyta, jog po gydymo sumažėjo IL-6 (kuris inhibuoja kaulų formavimąsį) ir TNF-α ekspresija, o priešuždegiminio citokino IL-10 ekspresija žymiai padidėjo. Šie pokyčiai parodo NF-κB aktyvumo sumažėjimą. [44]

Nustačius ląstelių, turinčių molekules, dalyvaujančias osteoklastų funkcijose: RANKL (NF-κB receptoriaus aktyvatorius) ir c-Fos (proto-onkogenas), sumažėjusius kiekius, nustatyta, kad IFN-β apsaugo nuo kaulinio audinio destrukcijos ir degradacijos. [44]

Grupėje, gydytoje su IFN-β buvo stebimas 50% artrito požymių sumažėjimas ir 70% sumažėjęs letenų prakaito kiekis, lyginant su kontroline grupe. Priklausomybės nuo dozės nebuvo pastebėta. Histologiniuose mėginiuose buvo nustatytas mažesnis uždegiminių ląstelių kiekis, 50% mažiau makrofagų ir 70% mažiau granuliocitų. Šie rezultatai parodo, jog IFN-β turi priešuždegiminį poveikį esant reumatoidiniam artritui. [44]

Taigi, tyrimo rezultatai parodė, jog IFN-β turi teigiamą poveikį RA gydyme, jis sumažina sinovinio audinio uždegimą ir apsaugo kremzles bei kaulus nuo destrukcijos. [44]

4.2.3. IFN-β poveikis esant RA (rezus beždžionėms)

P.P.Tak tyrimuose [4] keturioms rezus beždžionėms suleidus Freud adjuvanto emulsiją buvo sukeltas RA. Po mėnesio išmatavus reaktyvaus baltymo C (RBC) kiekį, buvo patvirtintas reumatoidinis artritas ir pradėtas gydymas IFN-β, nors klinikinių simptomų dar nebuvo matyti. Jau po savaitės gydymo buvo nustatytas CRB sumažėjimas. Ryškus teigiamas IFN-β efektas buvo matomas dviem beždžionėms:

Pirmajai neatsirado klinikinių artrito požymių, tai reiškia, jog IFN-β užkirto kelią artrito vystymuisi. Šis atvejis parodo, jog IFN-β gydymas yra ypač efektyvus ankstyvose artrito stadijose. [4]

Antroji beždžionė, kurios sąnariai dėl artrito buvo pažeisti, po gydymo vėl tapo fiziškai aktyvi, daug judėjo, laipiojo ir kabojo ant medžių šakų. Rezultatai kaip šis, kai atsakas į gydymą buvo toks greitas ir ryškus, prieš tai nebuvo gauti jokiuose tyrimuose. Toks klinikinis pagerėjimas parodo, jog IFN-β sumažino sąnarių skausmus. [4]

Nutraukus gydymą IFN-β, CRB kiekiai vėl padidėjo. [4]

4.3. Šalutiniai poveikiai

Dažniausiai pasireiškiantis šalutinis poveikis (~60% pacientų), tai į gripą panašus sindromas, kurio metu pasireiškia karščiavimas, šaltkrėtis, galvos ir raumenų skausmas, prakaitavimas, „kaulų laužymas“, nuovargis, vangumas, galvos svaigimas, sutrikęs mąstymas ir kt. Šis sindromas pasireiškia praėjus kelioms valandoms arba dienoms po IFN-β injekcijos. Įtariama, jog moterims ir pacientams, kurių maža kūno masė, yra didesnė rizika susirgti šiuo sindromu.

Kiti mažiau pasireiškiantys šalutiniai efektai:

Injekcijos vietos nekrozė

Depresija, polinkis į savižudybę

Mėnesinių ciklo sutrikimai

Padidėjęs jautrumas

Nerimas ir emocinis labilumas

[46 p.807, 47 p.235, 48 p.3647]

Helmar C. Lehmann [49] aprašė atvejį, kai po gydymo IFNβ moteriai išsivystė progresuojanti daugiažidinė leukoencefalopatija (PML). 2009m. pacientei buvo nustatytas CIS (clinically isolated syndrome – kliniškai izoliuotas sindromas), po dviejų metų simptomams paūmėjus, buvo paskirtas gydymas IFN-β-1a (Avonex®). 2014 metais pacientei išsivystė PML. Tai nustačius, buvo nutrauktas gydymas IFN-β-1a.

Tai pirmas atvejis, kai IS sergančiam pacientui, po interferono terapijos išsivys. . .

013) 12: 563-572.

23. Mergulhão FJM, Summers DK and Monteiro GA. Recombinant protein secretion in Escherichia coli. Biotechnol.Advances (2005) 23: 177-202.

24. Mohammad Hossein Morowvat, Valiollah Babaeipour, Hamid Rajabi-Memari, Hossein Vahidi and Nader Maghsoudi. Overexpression of Recombinant Human Beta Interferon (rhIFN-β) in Periplasmic Space of Escherichia coli. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014),13(supplement): 151-150.

25. Karpusas M, Whitty A, Runkel L, Hochman P. The structure of human interferon-beta: implications for activity. Cell Mol Life Sci (1998) 54: 1203–1216.

26. Sola RJ, Griebenow K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J Pharm Sci. (2009) 98: 1223–1245.

27. Song Kyoung, Yoon I-S, Kim NA, Kim D-H, Lee J, et al. Glycoengineering of Interferon-b 1a Improves Its Biophysical and Pharmacokinetic Properties. PLoS ONE (2014) 9(5): e96967.

28. Yang CH, Wu PC, Huang YB, Tsai YH. A new approach for determining the stability of recombinant human epidermal growth factor by thermal Fourier transform infrared (FTIR) microspectroscopy. J Biomol Struct Dyn (2004) 22: 101–110.

29. Dong A, Prestrelski SJ, Allison SD, Carpenter JF. Infrared spectroscopic studies of lyophilization- and temperature-induced protein aggregation. J Pharm Sci (1995) 84: 415–424.

30. Fan H, Ralston J, Dibiase M, Faulkner E, Middaugh CR. Solution behavior of IFN-beta-1a: an empirical phase diagram based approach. J Pharm Sci (2005) 94: 1893–1911.

31. Papanikou E, Karamanou S and Economou A. Bacterial protein secretion through the translocase nanomachine. Nat. Rev. Microbiol. (2007) 5: 839-851.

32. Ghane M, Yakhchali B and Khodabandeh M. Over Expression of Biologically Active Interferon Beta Using Synthetic Gene in E. coli. J. Sci. Islamic Repub. Iran. (2008) 19: 203-209.

33. Krishna Rao DV, Tulasi Ramu C, Venkateswara Rao J, Lakshmi Narasu M and Bhujanga Rao AKS. Cloning, high expression and purification of recombinant human intereferon-β-1b in Escherichia coli. Appli. Biochem. Biotechnol. (2009) 158: 140-154.

34. Kaubrys GF, Kizlaitienė R. Išsėtinė sklerozė. Klinikinė neurologija. Vaistų žinios (2009) 277.

35. Raine CS. The Dale E. McFarlin memorial lecture: the immunology of the multiple sclerosis lesion. Ann Neurol (1994) 36:S61–72.

36. The Interferon b Multiple Sclerosis Study Group, Clinical results of a multicenter, randomized, double-blind placebo controlled trail. Neurology (1993) 43:655–61.

37. The UBC MSrMRI Study Group, IFN b MS Study Group, Paty DW, Li DKB. Interferon b 1b is effective in relapsing and remitting multiple sclerosis: II. MRI analysis results of amulticenter, randomized, double-blind placebo controlled trail. Neurology (1993) 43:662–7.

38. Jacobs LD, Cookfair DL, Rudick RA, Herndon RM, Richert JR, Salazar AM, et al. Intramuscular interferon beta-1a for disease progression in relapsing multiple sclerosis. The Multiple Sclerosis Collaborative Research Group (MSCRG). Ann Neurol. (1996) 39: 285–294.

39. Calabresi PA, Stone LA, Bash CN, Frank JA, McFarland HF. Interferon beta results in immediate reduction of contrast-enhanced MRI lesions in multiple sclerosis patients followed by weekly MRI. Neurology. (1997) 48: 1446–1448.

40. Robert AB, Sporn MB. Transforming growth factor beta. Adv Cancer Res (1988) 51:107–45.

41. Yasuda CL, Al-Sabbagh A, Oliveira EC, Diaz-Bardales BM, Garcia AA, Santos LM. Interferon beta modulates experimental autoimmune encephalomyelitis by altering the pattern of cytokine secretion. Immunol Invest (1999) 28:115–26.

42. Porteu F, Nathan C. Shedding of tumor necrosis factor receptors by activated human neutrophils. J Exp Med (1990) 172:599–607.

43. Misiūnienė N., Baranauskaitė A. Reumatoidinio artrito diagnozavimas ir gydymas. Medicina. Tomas 38. Nr. 1, (2002) 38(1):110-116.

44. J. van Holten, K. Reedquist, P. Sattonet-Roche, t. JM Smeets, Ch. Plater-Zyberk, M. J Vervoordeldonk and Paul P Tak. Treatment with recombinant interferon-β reduces inflammation and slows cartilage destruction in the collagen-induced arthritis model of rheumatoid arthritis Arthritis Res Ther (2004) 6:R239-R249.

46. R. Jankūnas, P. Čekauskas, L. Pečiulienė, D. Bacevičienė, I. Pinčiūnė, Vaistų žinynas 2011m. Dešimtas leidimas, Vaistų žinios, Vilnius (2011) 615.2/.3 (035)

47. Gary Walsh. p., Pharmaceutical biotechnology: concepts and applications. John Wiley & Sons Ltd (2007) ISBN: 978-0-470-01244-4.

48. McEvoy GK, ed in chief, Snow ED, ed. AHFS: Drug Information. Bethesda, MD: American Society of Health-System Pharmacists; (2012) ISBN: 978-1-58528-418-4

49. Helmar C. Lehmann, Klaus Kruger, Gereon R. Fink, Michael Schroeter. Progressive multifocal leukoencephalopathy after interferon beta-1a monotherapy, J Neurol (2015) 262:771–773.

50. Stefania Spada, Gary Walsh Directory of Approved Biopharmaceutical Products – CRC Press Book, Taylor & Francis e-Library (2005) ISBN 9780415263689.

Join the Conversation

×
×