Rekombinantinio interferono-β gamyba ir terapinis pritaikymas

398 0

Referatas

Rekombinantinio interferono-β gamyba ir terapinis pritaikymas

Turinys

1. Įvadas 2

2. Interferonas beta 3

2.1. Interferonų tipai 3

2.2. I tipo interferonų funkcijos 3

2.3. Interferono-β panaudojimas 3

3. Interferono sintezė 4

3.1. Rekombinantinis interferonas-β 4

3.2. Rekombinantinio interferono-β sintezė 4

3.3. Rekombinantinio IFN-β sintezės tobulinimo tyrimai 5

3.3.1. Glikozilinimo įtaka IFN-β-1a aktyvumui 5

3.3.2. IFN-β-1b sekrecijos į periplazminę ertmę pritaikymas sintezėje 6

4. Interferono beta terapinis pritaikymas 10

4.1. Išsėtinė sklerozė 10

4.1.1. Ligos apibūdinimas 10

4.1.2. IFN-β veikimo mechanizmai 10

4.2. Reumatoidinis artritas 12

4.2.1. Ligos apibūdinimas 12

4.2.2. IFN-β poveikis esant RA (pelėms) 12

4.2.3. IFN-β poveikis esant RA (rezus beždžionėms) 13

4.3. Šalutiniai poveikiai 14

4.4. Interferono-β preparatai 15

4.4.1. Avonex 15

4.4.2. Rebif 15

4.4.3. Betaseron/Betaferon 16

5. Išvados 17

6. Informacijos šaltiniai 18

1. J. van Holten, C. Plater-Zyberk, PP Ta

ak: Interferon-beta for treatment of rheumatoid arthritis. Arthritis Res (2002) 4:346-352. 18

1. Įvadas

Interferonai-β, tai svarbūs žmogaus organizmui baltymai, atliekantys įvairias funkcijas organizme. Jie natūraliai randami organizme, taip pat genų inžinerijos metodais yra sintetinami jų preparatai.

Medicininiais tikslais yra kuriamos įvairios interferono-β formos, kurios skiriasi savo biologinėmis savybėmis, aktyvumu. Jų veikimą ir aktyvumą lemia sintezės metodai, naudojamos ląstelės, medžiagos, vektoriai. Šiame darbe bus apžvelgti keli interferono-β gamybos būdai, bei tyrimai atliekami norint pagerinti preparatų savybes.

Genų inžinerijos metodais kuriamos interferono-β formos yra plačiai naudojamos medicinoje ligų gy

ydymui ar kontroliavimui. Darbe bus aprašytas interferono-β terapinis veikimas, bei prekyboje esantys jo preparatai.

2. Interferonas beta 2.1. Interferonų tipai

Interferonai – tai natūraliai sintetinamų baltymų šeima, pasižyminti ryškiomis imuninių mediatorių funkcijomis. [1] Jie skirstomi į dvi grupes, tai I tipo interferonai (IFN-α ir IFN-β) ir II

I tipo interferonai (IFN-γ). [2,3] Šios dvi interferonų grupės atlieka priešingas funkcijas, IFN-γ skatina uždegiminius procesus, o IFN-β pasižymi priešuždegiminėmis savybėmis [4]. IFN-α baltymų grupę sudaro apie 20 struktūriškai panašių polipeptidų, kuriuos sintetina daugiausiai mononukleariniai fagocitai ir todėl kartais jie vadinami leukocitų interferonu. IFN-β yra baltymas, kurį sintetina fibroblastai, epitelinės ir kitos ląstelės. IFN-β, dar vadinamas fibroblastų interferonu, yra sudarytas iš 166 amino rūgščių, jį koduojančiame gene nėra intronų ar aprašytų polimorfizmo atvejų. [5 p. 152,6,7]

2.2. I tipo interferonų funkcijos

I tipo IFN apsaugo organizmą nuo virusų ir aktyvina ląstelinį imunitetą, jie slopina virusų replikaciją skatindami ląsteles sintetinti įvairius fermentus, kurie slopina viruso RNR ir DNR transkripciją bei viruso replikaciją, šio tipo interferonai skatina I klasės HLA (angl. human leukocyte antigen – žmogaus leukocitų antigenų) mo

olekulių ekspresiją, kadangi CD8+ T citotoksiniai limfocitai atpažįsta svetimą antigeną, prisijungusį prie I klasės HLA molekulių. I tipo interferonai aktyvina I klasės HLA molekulių, asocijuotų su virusų antigenais infekuotų ląstelių paviršiuje, atpažinimą ir jų suardymą citotoksiniais T limfocitais. [5, p.152] IFN-β slopina uždegimo mediatorius (citokinus): interleukiną-1 (IL-1β) ir navikų nekrozės faktorių (TNF-α), taip pat skatina interleukino-10 (IL-10) bei IL-1 receptorių antagonistų sintezę [8], slopina T ląstelių proliferaciją ir migraciją, užkerta kelią nuo kontakto priklausančiai T ląstelių monocitų aktyvacijai [9]. Taip pa
at atrasta, jog IFN-β skatina transformuojančio augimo faktoriaus (TGF-β1), ir šio faktoriaus antro tipo receptoriaus (TGF-β-R-II), genų ekspresiją mononuklearinėse periferinio kraujo ląstelėse. [10]

2.3. Interferono-β panaudojimas

Dėl savo savybių, interferonas-β vis dažniau naudojamas medicinoje, kaip potencialiai aktyvus vaistas imuninėms ligoms gydyti. Interferono-β terapija mažina išsėtinės sklerozės paūmėjimų skaičių. [11] Manoma, jog IFN-β turi priešuždegiminį poveikį esant artritui, nes pastebėta, jog esant dideliam IFN-β kiekiui kraujo serume, sumažėja ankstyvaus chroninio artrito sukeliamas sąnarių skausmas. [12,13] Taip pat tiriamas IFN-β poveikis esant infekcinėms ligoms [14], išorinių lytinių organų karpoms [15], piktybinei melanomai [16] ar kitoms onkologinėms būklėms [17].

3. Interferono sintezė 3.1. Rekombinantinis interferonas-β

Yra du rekombinantinio žmogaus interferono-β tipai. (1 pav.) Pirmas, rhIFN-β-1a yra glikozilintos formos, jis yra sintetinamas žinduolių ląstelėse, dažniausiai Kinų žiurkėno kiaušidžių (CHO – Chinese Hamster Ovary) ląstelėse. Šio tipo rIFN-β amino rūgščių seka yra identiška žmogaus interferono-β aminorūgščių sekai. [18] Antro tipo, rhIFN-β-1b, yra sintetinamas Escherichia coli bakterijose, jis nėra glikozilintas [19], be to jame yra ne 166, o 156 amino rūgštys ir 17-oji yra ne cisteino, o serino amino rūgštis (Cys→Ser). [20] Terapinis rhIFN-β-1a pavadinimas yra Avonex arba Rebif, o rhIFN-β-1b – Betaseron. [19]

1 pav. Abiejų interferono-β tipų struktūra. Kairėje – rhIFN-β-1a, kuris yra glikozilintos formos, dešinėje – IFN-β-1b, kuriame cisteino amino rūgštis yra pakeista į serino aminorūgštį.

3.2. Rekombinantinio interferono-β sintezė

Didžioji dalis rekombinantinių bal

ltymų yra sintetinami rekombinantinės DNR technologijos būdu gram neigiamose Escherichia coli bakterijose, nes jos geba greitai augti tankiose terpėse, yra nuodugniai ištirta jų genetika ir fiziologija bei joms galima pritaikyti daugumą biotechnologijų, daugumą klonavimo vektorių. [21,22] Escherichia coli geba sekretuoti baltymus į periplazminį tarpą (tarpmembraninę ertmę), tai pranašumas lyginant su baltymų sinteze ląstelės viduje, nes išvengiama intarpinių kūnelių susidarymo. Tai supaprastina nuoseklų sintezės procesą, baltymų stabilumą, gryninimą ir N-galo apdorojimą, taip pat sumažina baltymo degradaciją, be to, periplazmos aerobinė aplinka lemia tikslų potransliacinį baltymų susisukimą. [23] Žmogaus interferonas-β pagamintas E. coli yra toksiškas pačiai bakterijai, bet šio rekombinantinio baltymo susikaupimas periplazmoje sumažina jo mirtiną poveikį ląstelei. [24]

Norint sukurti geresnių savybių interferono-β prepartatus, vykdomas jų glikozilinimas. Baltymo glikozilinimas nereikalauja papildomos manipuliacijos sintezės metu, nes tai yra natūralus baltymų modifikacijos procesas vykstantis žinduolių ląstelėse. Yra žinoma, jog glikozilinimas yra svarbus rhIFN-β aktyvumui. [19,25] rhIFN-β-1a, kuris yra glikozilintos formos, pasižymi didesniu specifišku aktyvumu ir imunogeniškumu, nei rhIFN-β-1b [19]. Tyrimai parodė, jog šį žymų skirtumą lemia glikozilinimas, nes polisacharido fragmentas nulemia baltymo stabilumą, tirpumą ir biologinį aktyvumą. Todėl glikozilinimas gali būti puikus metodas gerinti biofizines glikoproteinų savybes, tokias kaip jų struktūros stabilumas ar farmakokinetika [26].

3.3. Rekombinantinio IFN-β sintezės tobulinimo tyrimai

Atliekami tyrimai, norint nepažeidžiant rhIFN-β aktyvumo, pagerinti jo biologines sav

vybes, tokias kaip agregacija, produktyvumas, stabilumas ir farmakokinetinis aktyvumas.

3.3.1. Glikozilinimo įtaka IFN-β-1a aktyvumui

Kyoung Song su kolegomis atliko tyrimą [27], kurio metu, atliekant žinomos vietos mutaciją, buvo kuriama rhIFN-β forma su papildomu glikozilinimu. Ši forma buvo pavadinta R27T ir apibrėžta kaip rhIFN-β-1a su mutacija 27 vietoje (Thr pakeista į Arg) ir su dvejomis N-glikozilintomis sritimis: prie 80-os (originali vieta) amino rūgšties ir prie 25-os amino rūgšties (papildoma vieta). Šis glikozilinimas neturėjo įtakos baltymo jungimuisi su ligandu, taip pat nebuvo užfiksuota jokio specifinio aktyvumo. R27T baltymas buvo stabilesnis ir mažiau linkęs į agregaciją, taip pat turėjo ilgesnį gyvavimo pusperiodį. [27]

 

2 pav. – rhIFN-β baltymo schema. Stačiakampiai (A, B, C, D, E) nurodo penkių α-kilpų vietas. Kiekviena vertikali linija nurodo potencialias N-galo glikozilinimo vietas, įvykęs oligosacharido prijungimas – R27 ir N80 vietose. [27]

Kyoung Song eksperimento metu glikozilinti analogai buvo sukurti PGR metodu, atliekant žinomos vietos mutaciją, naudojant natūralų IFN-β. Viso ilgio genas buvo atkurtas ir klonuotas į pMSG genų ekspresijos vektorių. Stabilus geno įterpimas į CHO ląsteles buvo atliktas naudojant dihidrofolato reduktazės atrankos sistemą, metotreksatui atsparūs klonai buvo užauginti metotreksatu žymėtoje terpėje. rhIFN-β-1a ir rhIFN-β mutuoti baltymai (R27T) buvo išgryninti aukšto slėgio chromatografijos (HPLC) ir gel-elektroforezės metodais. Gauti produktai buvo nustatomi SDS-PAGE ir . . .

tiple sclerosis lesion. Ann Neurol (1994) 36:S61–72.

36. The Interferon b Multiple Sclerosis Study Group, Clinical results of a multicenter, randomized, double-blind placebo controlled trail. Neurology (1993) 43:655–61.

37. The UBC MSrMRI Study Group, IFN b MS Study Group, Paty DW, Li DKB. Interferon b 1b is effective in relapsing and remitting multiple sclerosis: II. MRI analysis results of amulticenter, randomized, double-blind placebo controlled trail. Neurology (1993) 43:662–7.

38. Jacobs LD, Cookfair DL, Rudick RA, Herndon RM, Richert JR, Salazar AM, et al. Intramuscular interferon beta-1a for disease progression in relapsing multiple sclerosis. The Multiple Sclerosis Collaborative Research Group (MSCRG). Ann Neurol. (1996) 39: 285–294.

39. Calabresi PA, Stone LA, Bash CN, Frank JA, McFarland HF. Interferon beta results in immediate reduction of contrast-enhanced MRI lesions in multiple sclerosis patients followed by weekly MRI. Neurology. (1997) 48: 1446–1448.

40. Robert AB, Sporn MB. Transforming growth factor beta. Adv Cancer Res (1988) 51:107–45.

41. Yasuda CL, Al-Sabbagh A, Oliveira EC, Diaz-Bardales BM, Garcia AA, Santos LM. Interferon beta modulates experimental autoimmune encephalomyelitis by altering the pattern of cytokine secretion. Immunol Invest (1999) 28:115–26.

42. Porteu F, Nathan C. Shedding of tumor necrosis factor receptors by activated human neutrophils. J Exp Med (1990) 172:599–607.

43. Misiūnienė N., Baranauskaitė A. Reumatoidinio artrito diagnozavimas ir gydymas. Medicina. Tomas 38. Nr. 1, (2002) 38(1):110-116.

44. J. van Holten, K. Reedquist, P. Sattonet-Roche, t. JM Smeets, Ch. Plater-Zyberk, M. J Vervoordeldonk and Paul P Tak. Treatment with recombinant interferon-β reduces inflammation and slows cartilage destruction in the collagen-induced arthritis model of rheumatoid arthritis Arthritis Res Ther (2004) 6:R239-R249.

46. R. Jankūnas, P. Čekauskas, L. Pečiulienė, D. Bacevičienė, I. Pinčiūnė, Vaistų žinynas 2011m. Dešimtas leidimas, Vaistų žinios, Vilnius (2011) 615.2/.3 (035)

47. Gary Walsh. p., Pharmaceutical biotechnology: concepts and applications. John Wiley & Sons Ltd (2007) ISBN: 978-0-470-01244-4.

48. McEvoy GK, ed in chief, Snow ED, ed. AHFS: Drug Information. Bethesda, MD: American Society of Health-System Pharmacists; (2012) ISBN: 978-1-58528-418-4

49. Helmar C. Lehmann, Klaus Kruger, Gereon R. Fink, Michael Schroeter. Progressive multifocal leukoencephalopathy after interferon beta-1a monotherapy, J Neurol (2015) 262:771–773.

50. Stefania Spada, Gary Walsh Directory of Approved Biopharmaceutical Products – CRC Press Book, Taylor & Francis e-Library (2005) ISBN 9780415263689.

Join the Conversation